一种高纯度CD56阳性细胞的富集培养方法技术

技术编号:13899033 阅读:179 留言:0更新日期:2016-10-25 11:07
本发明专利技术涉及一种高纯度CD56阳性细胞的富集培养方法,所述方法包括:从外周血单核细胞分离出CD56阳性细胞,再将CD56阳性细胞与CD56阴性细胞按1:0.5~4比例混合培养,并利用白介素2(rhIL‑2)、白介素15(rhIL‑15)、OKT‑3以及烟碱氨(NAM)等细胞因子的刺激下进行培养,培养21天以上。本发明专利技术提供一种高纯度CD56阳性细胞的制备方法,能够显著提高CD56阳性细胞的数量、显著提高CD56阳性细胞纯度,提高细胞免疫治疗的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种高纯度CD56阳性细胞的富集培养方法。(二)
技术介绍
自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是一群细胞表面表达CD3-CD56+的淋巴细胞,是机体重要的免疫细胞,与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节密切相关。NK细胞对肿瘤细胞或受感染细胞的杀伤既不依赖抗体参与,也不需要抗原刺激和致敏;通过以下方式对靶细胞造成杀伤:1、识别靶细胞无MHC限制,直接与靶细胞接触释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞;2、释放NK细胞毒因子与靶细胞的NKCF受体结合,选择性杀伤和裂解靶细胞;3、通过抗体依赖的细胞毒作用对靶细胞造成杀伤。NKT(natural killer T)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR,又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群,是一群细胞表面表达CD3+CD56+的淋巴细胞。NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性,可溶解NK细胞敏感的靶细胞,主要效应分子为穿孔素,Fas配体以及IFN-γ,与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节密切相关。细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗方法,现有研究表明,肿瘤患者经手术、放化疗等手段治疗后,联合细胞免疫治疗,可以有效清除体内手术后残余的癌细胞,延长肿瘤患者的无复发生存率,并提高总生存率。目前,临床上所使用的细胞免疫治疗主要有DC-CIK、NK细胞等,其主要的效应细胞分别为:CD3+CD56+的NKT细胞及
CD3-CD56+的NK细胞,因此,临床上采用细胞免疫治疗方法杀伤肿瘤时,对CD56阳性细胞的数量、纯度具有较高的要求。目前已有的免疫细胞培养方法具有:CD56阳性细胞扩增的数量有限、所获得的CD56阳性细胞纯度较低、对残留的肿瘤细胞的杀伤效果有限等缺点。因此,寻找更加理想的CD56阳性细胞培养方法,以期获得更高的CD56阳性细胞数量、更高的CD56阳性细胞纯度已成为科研人员的重要目标。综上所述,开发高纯度CD56阳性细胞的制备方法,具有极大的应用前景。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高纯度CD56阳性细胞的富集培养方法,使得所述方法能够显著提高CD56阳性细胞的数量、显著提高CD56阳性细胞纯度,提高细胞免疫治疗的治疗效果。本专利技术采用的技术方案是:一种高纯度CD56阳性细胞的富集培养方法,所述方法包括:从外周血单个核细胞(PBMC)中富选分离CD56阳性细胞和CD56阴性细胞,将CD56阳性细胞与CD56阴性细胞按1:0.5~4的比例混合、于共混培养液中共培养21天以上,获得高纯度CD56阳性细胞;所述共混培养液组成如下:1~10%自体血清或AB型血清或血清白蛋白;200IU/mL~1500IU/mL IL-2(白细胞介素-2),1ng/mL~20ng/mL IL-15(白细胞介素-2),1ng/mL~20ng/mL OKT-3(PeproTech CD3功能性抗体),1mmol/mL~20mmol/mL烟碱氨(NAM),溶剂为基础细胞培养液。通过该方法而获得的CD56阳性细胞可作为一种细胞免疫疗法的医药组合物,主要用于治疗和/或预防传染病和/或癌症,所述疾病包括但不
限于例如口腔癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、肝癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、白血病、或者由病毒、细菌等引起的传染病。有时本专利技术制备的高纯度CD56阳性细胞治疗可以通过单独或组合外科疗法、化学疗法、放射疗法等来实施。本专利技术制备的高纯度CD56阳性细胞,有时CD56阳性细胞通过静脉、动脉、皮下、腹腔内等施用来移植。本专利技术制备的高纯度CD56阳性细胞,有时被施用于具有不同的HLA基因型的患者。所述基础细胞培养液可为本领域常规细胞培养基,具体可为下列之一:GT-T551H3培养液(Takara Bio,宝日医生物技术(北京)有限公司)、CellGro SCGM培养液(CellGenix,岩井化学药品株式会社)、AIM V培养液(thermofisher scientific,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)、IMDM培养液、MEM培养液、DMEM培养液、RPMI-1640培养液。作为培养条件,只要不损害CD56阳性细胞的扩增效果及CD56阳性细胞质量,则没有特别限制,通常,所述共培养在37℃、5%CO2及饱和水蒸气环境下进行。所述IL-2和IL-15优选具有人的氨基酸序列,从安全上考虑,优选通过重组DNA技术来生产。所述共混培养液组成如下:2%自体血清或AB型血清或血清白蛋白;500IU/mL rhIL-2(重组白细胞介素-2),10ng/mL rhIL-15(重组白细胞介素-15),10ng/mL OKT-3,5mmol/mL烟碱氨,溶剂为GT-T551H3培养液。具体的,所述方法如下:(1)取静脉外周血,加入等体积生理盐水稀释,在各离心管中,先加入10~15mL的FicollPaque溶液,再缓慢加入稀释的血液,离心、
收集中间层细胞,生理盐水洗涤2~3次,再用生理盐水重悬,离心后去除上清,悬浮于添加2mM EDTA和0.1%BSA的PBS中,即得单个核细胞悬浮液,细胞溶度为每80μL含有1×107个细胞;由外周血分离的单个核细胞通常被冷冻保存,并根据向患者的移植时间来解冻,供于CD56阳性细胞的分离及扩增。或者,所述单核细胞在通过本专利技术的CD56阳性细胞的扩增方法扩增的途中、或在扩增结束后被冷冻,并根据向患者的移植时间来解冻,供于向患者的移植。血细胞的冷冻及解冻可以使用本领域公知的方法。有时在所述细胞的冷冻中,可以使用任意一种市售的细胞冷冻保存液。(2)单个核细胞悬浮液加入CD56标记的磁珠微球,充分混匀后置于4~8℃下反应15~20分钟,然后加入含0.1%BSA的PBS清洗1~2次,离心除去上清,悬浮于添加有0.1%BSA的PBS中,细胞浓度为2×108个/mL;然后,将磁珠分离柱子置于磁场中,将所述悬浮液加入磁珠分离柱中,并用添加有0.1%BSA的PBS清洗柱子2次,收集滤过液,即为CD56阴性细胞;除去磁珠分离柱的磁场,将标记的细胞用添加有0.1%BSA的PBS洗出,置于新的离心管中,即为CD56阳性细胞;(3)将所述CD56阴性细胞与CD56阳性细胞以1:1的比例混合,重悬于共混培养液中,细胞浓度为1×106个/mL,在37℃、5%CO2及饱和水蒸气环境下培养21天,获得高纯度CD56阳性细胞;所述共混培养液组成如下:2%自体血清或AB型血清或血清白蛋白;500IU/mL rhIL-2,10ng/mL rhIL-15,10ng/mL OKT-3,
5mmol/mL烟碱氨,溶剂为GT-T551H3培养液。本专利技术的有益效果主要体现在:采用本专利技术方法,能够显著提高CD56阳性细胞的数量、显著提高CD56阳性细胞纯度,提高细胞免疫治疗的治疗效果。(四)附图说明图1为在使用磁珠法富选CD56阳性细胞后,使用对CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法进行鉴定的结果图。图2为在使用磁珠法富选CD56阳性细胞后,经本专利技术提供的高纯度CD56阳性细胞的制备方法制备的CD56阳性细胞,使用倒置显微镜观察CD56阳性细胞的生长形本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种高纯度CD56阳性细胞的富集培养方法,所述方法包括:从外周血单个核细胞中富选分离CD56阳性细胞和CD56阴性细胞,将CD56阳性细胞与CD56阴性细胞按1:0.5~4的比例混合、于共混培养液中共培养21天以上,获得高纯度CD56阳性细胞;所述共混培养液组成如下:1~10%自体血清或AB型血清或血清白蛋白;200IU/mL~1500IU/mL IL‑2,1ng/mL~20ng/mL IL‑15,1ng/mL~20ng/mL OKT‑3,1mmol/mL~20mmol/mL烟碱氨,溶剂为基础细胞培养液。

【技术特征摘要】
1.一种高纯度CD56阳性细胞的富集培养方法,所述方法包括:从外周血单个核细胞中富选分离CD56阳性细胞和CD56阴性细胞,将CD56阳性细胞与CD56阴性细胞按1:0.5~4的比例混合、于共混培养液中共培养21天以上,获得高纯度CD56阳性细胞;所述共混培养液组成如下:1~10%自体血清或AB型血清或血清白蛋白;200IU/mL~1500IU/mL IL-2,1ng/mL~20ng/mL IL-15,1ng/mL~20ng/mL OKT-3,1mmol/mL~20mmol/mL烟碱氨,溶剂为基础细胞培养液。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述基础细胞培养液为下列之一:GT-T551H3培养液、CellGro SCGM培养液、AIM V培养液、IMDM培养液、MEM培养液、DMEM培养液、RPMI-1640培养液。3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述共培养在37℃、5%CO2及饱和水蒸气环境下进行。4.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述共混培养液组成如下:2%自体血清或AB型血清或血清白蛋白;500IU/mL rhIL-2,10ng/mL rhIL-15,10ng/mL OKT-3,5mmol/mL烟碱氨,溶剂为GT-T551H3培养液。5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述方法如下:(1)取静脉外周血,加入等体积生理盐水稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘景丰刘小龙郑友世廖乃顺蔡志雄
申请(专利权)人:福州市传染病医院
类型:发明
国别省市:福建;35

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