一种DC细胞的冻存液及冻存方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种DC细胞的冻存液及冻存方法。本发明专利技术所述DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMSO、低分子右旋糖酐、DMEM培养基和维生素C。本发明专利技术所述DC细胞的冻存方法为向DC细胞中加入本发明专利技术所述冻存液，混匀后冻存。采用本发明专利技术所述冻存液冻存DC细胞，明显提高了DC细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种DC细胞的冻存液及冻存方法。
技术介绍
DC细胞又叫做树突状细胞，属于已知细胞中抗原提呈能力最强的一种细胞，因此有许多肿瘤病患的临床治疗方案都以DC细胞作为研究对象。但是DC细胞培养需要较长时间，并且冻存后的血液无法培养出DC细胞，因此在治疗肿瘤病人的时候，必须抽取病人的新鲜血液然后再通过14-30天的培养过程来扩增细胞再进行回输。这样就会有一些问题存在，首先就是肿瘤病人血液质量较差，很难扩增出足够的DC细胞；其次扩增时间较长，病人等待时间过长等。因此如果能够在病人情况较好的时候抽取外周血，并培养出DC细胞并冻存起来，在需要的时候复苏细胞进行回输，便可以大大方便治疗过程，提高疗效。然而现在尚无明确能够冻存DC细胞的冻存液配方，通常采用通用的90％FBS+10％DMSO进行DC细胞的冻存。但90％FBS+10％DMSO的冻存液冻存DC细胞效果很差，复苏后DC细胞的活率偏低，并且无法再继续增殖。现有冻存液中含有大量牛血清，有可能会引起严重的过敏反应，并且带来了外源性病毒的风险，因此无法进行临床使用。而且现有冻存液中DMSO含量过高，在临床输注时风险较大。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种DC细胞的冻存液及冻存方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMSO、低分子右旋糖酐、DMEM培养基和维生素C。作为优选，所述冻存液由下述成分组成：在一些实施方案中，所述冻存液由下述成分组成：在一些实施方案中，所述冻存液由下述成分组成：在一些实施方案中，所述冻存液由下述成分组成：本专利技术还提供了一种DC细胞的冻存方法，向DC细胞中加入本专利技术所述冻存液，混匀后冻存。其中，本专利技术所述的冻存方法中所述冻存液的加入量为至DC细胞密度为1×107-3×107。本专利技术所述的冻存方法中所述冻存优选为放入-80℃冰箱，24小时后转入液氮保存。将单个核细胞(PBMC)用DMEM培养基按照2×106/mL的密度重悬，然后和所述培养基的组分1按照1:1的体积比混合后，37℃，5％CO2培养箱中培养；期间每3天按照总体积的二分之一补加所述培养基的组分2。本专利技术所述冻存方法中所述DC细胞可以由单个核细胞(PBMC)培养得到。在一些实施方案中，所述DC细胞培养方法具体为PBMC用RPMI1640培养基重悬至密度为5×105-1×106/ml，37℃，5％CO2培养3小时；弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10％FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培养6天，收集DC细胞。本领域技术人员可知，本专利技术所述单个核细胞可以由外周血或脐带血分离得到。在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500-800g离心20-30min。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种DC细胞的冻存液及冻存方法。本专利技术所述DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMSO、低分子右旋糖酐、DMEM培养基和维生素C。本专利技术所述DC细胞的冻存方法为向DC细胞中加入本专利技术所述冻存液，混匀后冻存。采用本专利技术所述冻存液冻存DC细胞，明显提高了DC细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示试验例中实施例1冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图2示试验例中实施例1冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图3示试验例中实施例1冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图4示试验例中实施例2冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图5示试验例中实施例2冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图6示试验例中实施例2冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图7示试验例中实施例3冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图8示试验例中实施例3冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图9示试验例中实施例3冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图10示试验例中对比例冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图11示试验例中对比例冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；图12示试验例中对比例冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了更好的理解本专利技术，下面结合具体实施例对本专利技术进行详细阐述。如无特殊说明本专利技术所述丙二醇为注射级。实施例1：冻存液配方：冻存方法:第0天抽取一定量外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用RPMI1640培养基重悬至密度为5×105-1×106/ml，放入培养瓶中培养箱中37℃，5％CO2培养3小时。弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10％FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培养6天。收集DC细胞，离心后去除上清，取一部分细胞用RPMI1640培养基重悬后检测细胞表面标志物。向沉淀中缓慢加入上述冻存液，混匀，调整细胞密度到1×107-3×107，检测细胞活率。将混匀的细胞悬液加入冻存管中，放入-80℃冰箱，24小时后转入液氮保存。选取冻存1个月、3个月、6个月的DC细胞，37℃水浴锅解冻复苏，保证复苏时间小于2分钟。将复苏后的细胞加入RPMI1640培养基重悬，用1640培养基将细胞悬液中原本带有的冻存液的比例稀释至5％以下，离心去除上清，再次用RPMI1640培养基重悬后抽取部分检测细胞表面标志物以及细胞活率。剩余细胞用含有10％FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培养6天，观察细胞增殖情况并制定增殖曲线。实施例2：冻存液配方：冻存方法:第0天抽取一定量外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用RPMI1640培养基重悬至密度为5×105-1×106/ml，放入培养瓶中培养箱中37℃，5％CO2培养3小时。弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10％FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培养6天。收集DC细胞，离心后去除上清，取一部分细胞用RPMI1640培养基重悬后检测细胞表面标志物。向沉淀中缓慢加入上述冻存液，混匀，调整细胞密度到1×107-3×107，检测细胞活率。将混匀的细胞悬液加入冻存管中，放入-80℃冰箱，24小时后转入液氮保存。选取冻存1个月、3个月、6个月的DC细胞，37℃水浴锅解冻复苏，保证复苏时间小于2分钟。将复苏后的细胞加入RPMI1640培养基重悬，用1640培养基将细胞悬液中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMSO、低分子右旋糖酐、DMEM培养基和维生素C。

【技术特征摘要】
1.一种DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMSO、低分子右旋糖酐、DMEM培养基和维生素C。2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成：3.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成：4.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成：5.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成：6.一种DC细胞的冻存方法，向DC细胞中加入权利要求1所述冻存液，混匀后冻存。7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存液的加入量为至...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，万桦，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44