抑制产气荚膜梭菌感染的重组β2蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了抑制产气荚膜梭菌感染的重组β2蛋白及其制备方法与应用。该重组β2蛋白为a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51‑286位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。该重组β蛋白免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可抵抗产气荚膜梭菌的攻击。该重组β蛋白可溶性好，纯化简易，可作为诊断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中抑制产气荚膜梭菌感染的重组β2蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，该病原是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，种类多达13种，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根据产生外毒素的种类不同，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E这五个血清型。β2毒素是产气荚膜梭菌所有毒素基因中最新发现的非常重要的一种外毒素，其中主要以B和C型的细菌可产生该毒素。产气荚膜梭菌的β2毒素导致动物传染病的防控是当前困扰动物疫病防控工作着的主要难题之一。传统疫苗在治疗和预防动物产气荚膜梭菌疾病方面虽然取得了一定的效果。但是，这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如传统疫苗免疫易引起动物局部炎症以及毒性反应等。研发能表达β2外毒素抗原蛋白，并且不破坏β2外毒素抗原蛋白的免疫原性，对产气荚膜梭菌β2外毒素引起的疫病起到防控作用的基因工程疫苗是急需解决的技术难题。现有技术中对产气荚膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制其应用的主要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。如何构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是如何获得抑制产气荚膜梭菌感染的可溶性蛋白质疫苗。为解决上述技术问题，本专利技术提供了制备重组β2蛋白的方法。本专利技术所提供的制备重组β2蛋白的方法，包括使重组β2蛋白的编码基因在生物中进行表达得到所述重组β2蛋白的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；所述重组β2蛋白为a)或b)或c)或d)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。上述方法中，a)的蛋白质名称为β2-his，b)的蛋白质名称为β2-Y。SEQ ID No.2由353个氨基酸残基组成。上述方法中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。上述方法中，所述使重组β2蛋白的编码基因在生物中进行表达包括所述重组β2蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组β2蛋白的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述重组β2蛋白。上述方法中，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物；C2)革兰氏阴性细菌；C3)埃希氏菌属细菌；C4)大肠杆菌BL21(DE3)。上述方法中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-861位所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述重组β2蛋白。其中，SEQ ID No.1由1068个核苷酸组成，其名称为β2-hisY基因，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质β2-his。SEQ ID No.1的第151-861位所示的DNA分子是β2-Y基因，编码由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列组成的蛋白质β2-Y。上述方法中，所述重组微生物为将pET30a-β2-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的重组β2蛋白的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-β2-Y，所述pET30a-β2-Y为将载体pET30a(+)的BamHI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第151-861位所示的DNA片段得到的重组载体。上述方法中，所述表达为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。下述任一种产品也属于本专利技术的保护范围：P1)重组β2蛋白，所述重组β2蛋白为a)或b)或c)或d)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质；P2)与所述重组β2蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：B1)编码所述重组β2蛋白的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；P3)预防动物产气荚膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重组β2蛋白或所述生物材料。上述产品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述产品中，所述重组β2蛋白按照上述任一种方法制备；所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-861位所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；所述重组载体为所述pET30a-β2-Y；所述重组微生物为E1)或E2)：E1)所述重组微生物为将所述重组β2蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组β2蛋白的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物；C2)革兰氏阴性细菌；C3)埃希本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备重组β2蛋白的方法，包括使重组β2蛋白的编码基因在生物中进行表达得到所述重组β2蛋白的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；所述重组β2蛋白为a)或b)或c)或d)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51‑286位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。

【技术特征摘要】
1.制备重组β2蛋白的方法，包括使重组β2蛋白的编码基因在生物中进行表达得到所述重组β2蛋白的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；所述重组β2蛋白为a)或b)或c)或d)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使重组β2蛋白的编码基因在生物中进行表达包括将所述重组β2蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组β2蛋白的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述重组β2蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物；C2)革兰氏阴性细菌；C3)埃希氏菌属细菌；C4)大肠杆菌BL21(DE3)。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-861位所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述重组β2蛋白。5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述重组微生物为将pET30a-β2-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的重组β2蛋白的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-β2-Y，所述pET30a-β2-Y为将载体pET30a(+)的BamHI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ IDNo.1第151-861位所示的DNA片段得到的重组载体。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述表达为诱导表达。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。8.下述任一种产品：P1)重组β2蛋白，所述重组β2蛋白为a)或b)或c)或d)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓晖，孙雨，翟新验，董浩，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京;11