CPMV增强子元件制造技术

技术编号:13781070 阅读:322 留言:0更新日期:2016-10-04 17:04
提供了表达增强子,其包含CPMV 5’UTR核苷酸序列,所述CPMV5’UTR核苷酸序列由X个核苷酸组成(CMPVX),其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个,或由包含与CMPVX具有约80%至100%序列相似性的核苷酸序列组成,其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个。所述表达增强子还可以包含与5’UTR核苷酸序列的3’端融合的填充序列(CMPVX+,其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个)。所述填充序列可以包含一个或多个植物kozak序列。还描述了包含所述表达增强子的植物以及利用所述表达增强子的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及目标蛋白在植物中的表达。本专利技术还提供了用于在植物中产生目标蛋白的方法和组合物。专利技术背景植物呈现出作为重组蛋白生产系统的巨大潜能。在植物中产生外来蛋白的一种方法是,生成稳定的转基因植物系。然而,这是一个耗时且费力的过程。转基因植物的替代物是使用基于植物病毒的表达载体。基于植物病毒的载体允许蛋白在植物中迅速、高水平、瞬时地表达。实现在植物中高水平瞬时表达外来蛋白的一个方法涉及使用基于RNA植物病毒的载体,包括豇豆花叶病毒属(comovirus),如豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus)(CPMV;参见,例如,WO2007/135480;WO2009/087391;US 2010/0287670,Sainsbury F.et al.,2008,Plant Physiology;148:121-1218;Sainsbury F.et al.,2008,Plant Biotechnology Journal;6:82-92;Sainsbury F.et al.,2009,Plant Biotechnology Journal;7:682-693;Sainsbury F.et al.2009,Methods in Molecular Biology,Recombinant Proteins From Plants,vol.483:25-39)。豇豆花叶病毒属是具有双分基因组的RNA病毒。豇豆花叶病毒的RNA基因组的片段被称作RNA-1和RNA-2。RNA-1编码VPg、复制酶和蛋白酶蛋白。复制酶是病毒用于复制病毒基因组所必需的。豇豆花叶病毒属的豇豆花叶病毒的RNA-2(CPMV),产生105kDa或95kDa的被加工为4个功能肽的多蛋白。CPMV RNA-2的5’区在115位、161位、512位和524位包含起始密码子(AUG)。161位和512位处的起始密码子在相同的三联体阅读框中。161位处起始密码子的起始导致105K多蛋白的合成,而512位处起始密码子的起始指导95K多蛋白的合成。CPMV中512位处的起始密码子的翻译起始比161位处的起始更高效,导致产生的95K多蛋白比105K多蛋白多。115位处的起始密码子不是用于病毒复制必需的(Wellink et al.,1993Biochimie.75(8):741-7)。对于通过RNA-1编码的复制酶来有效复制RNA-2,要求使所述框维持在CPMV RNA-2中的161位和512位处的起始位点之间(Holness et al.,1989;Virology 172,311-320;van Bokhoven et al.1993,Virology 195,377-386;Rohll et al.,1993Virology 193,672-679;Wellink et al.,1993,Biochimie.75(8):741-7)。该要求影响了可被插入复制形式的CPMV RNA-2表达载体的512处起始密码子上游的序列的长度。此外,多接头的使用必须小心,因为它们可以使密码子阅读框(ORF)在这些起始位点之间移动。CPMV已用作发展适合于在植物中产生异源多肽的载体系统的基础(Liu et al.,2005Vaccine 23,1788-1792;Sainsbury et al.,2007Virus Expression Vectors(Hefferon,K.ed),pp.339-555)。这些系统基于RNA-2的修饰,但区别在于:是使用全长形式还是缺失形式。通过与RNA-1混合接种(co-inoculation)实现被修饰的RNA-2的复制。将外来蛋白与源于RNA-2的多蛋白的C-端融合。通过来自口蹄疫病毒的2A催化肽序列的作用,介导N-端多肽的释放(Gopinath et al.,2000,Virology 267:159-173)。所得到的RNA-2分子在植物内以及植物之间均能够扩散。该策略已被用来在豇豆植物中表达多种重组蛋白,如乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和小免疫蛋白(SIP)(Mechtcheriakova et al.J.Virol.Methods 131,10-15;2006;Monger et al.,2006,Plant Biotechnol.J.4,623-631;Alamillo et al.,2006,Biotechnol.J.1,1103-1111)。尽管是成功的,但全长病毒载体的使用限制了插入序列的大小,并且在植物之间的移动引发关于病毒生物控制的担忧。为了处理生物控制和插入大小的问题,Canizares等人(2006Plant Biotechnol,J 4:183-193)用目标序列替换RNA-2的大部分编码区,以产生缺陷形式的CPMV RNA-2(deIRNA-2)。将待表达的序列与RNA-2的512位处的AUG融合(3’非翻译区(UTR)的紧邻上游),以产生模拟RNA-2的分子。在RNA-1和沉默抑制子的存在下,当此类构建体被引入至植物时能够复制,并且指导合成大量异源蛋白(Sainsbury et al.,2008Plant Biotechnol J 6:82-92)。CPMV RNA-2载体(U162C;HT)中161位处起始密码子的突变增加了由插在512位处起始密码子之后的序列所编码的蛋白的表达水平。这允许产生高水平的外来蛋白而不需要病毒的复制,并且被叫作CPMV-HT系统(WO2009/087391;Sainsbury and Lomonossoff,2008,Plant Physiol.148,1212-1218)。在pEAQ表达质粒中(Sainsbury et al.,2009,Plant Biotechnology Journal,7,pp 682-693;US 2010/0287670),待表达的序列位于5'UTR和3'UTR之间。pEAQ系列中的5’UTR携带有U162C(HT)突变。专利技术概述本专利技术涉及目标蛋白在植物中的表达。本专利技术还提供了用于在植物中产生目标蛋白的方法和组合物。如本文所述,提供包含CPMV 5’UTR核苷酸序列的表达增强子,所述CPMV 5’UTR核苷酸序列由X个核苷酸组成(CMPVX),其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个,或者由包含与CMPVX具有约80%至100%序列相似性的核苷酸序列组成,其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个。表达增强子可以包括选自SEQ ID NO:24、27、68、69、70和71的核苷酸序列。本专利技术还提供了如上所定义的表达增强子,其中所述表达增强子还包含填充序列(CPMVX+,其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个)。所述填充序列可以包括0至约100个核苷酸的长度或者介于两者之间的任意长度、一个或多个植物kozak序列、多克隆位点、一个或多个接头序列、一个或多个重组位点或以上的组合。本专利技术还提供了如上所定义的表达增强子,其中kozak序列选自SEQ ID NO:5-17中所示的序列。刚刚定义的表达增强子(CPMV本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达增强子,其包含CPMV 5’UTR核苷酸序列,所述CPMV5’UTR核苷酸序列由X个核苷酸组成(CMPVX),其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个,或者由与X个核苷酸的CMPVX具有约80%至100%序列相似性的核苷酸序列组成,其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.28 CA PCT/CA2014/050326;2014.01.10 US 61/91.表达增强子,其包含CPMV 5’UTR核苷酸序列,所述CPMV5’UTR核苷酸序列由X个核苷酸组成(CMPVX),其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个,或者由与X个核苷酸的CMPVX具有约80%至100%序列相似性的核苷酸序列组成,其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个。2.如权利要求1所述的表达增强子,其还包含长度约1至100个核苷酸的填充序列,所述填充序列与CMPV 5’UTR核苷酸序列的3’端融合(CMPVX+,其中X=SEQ ID NO:1中的160个、155个、150个或114个)。3.如权利要求2所述的表达增强子,其中所述填充序列包含植物kozak序列。4.如权利要求3所述的表达增强子,其中所述填充序列还包含多克隆位点。5.如权利要求3所述的表达增强子,其中所述kozak序列选自如SEQ ID NO:5-17中所示的序列。6.如权利要求2所述的表达增强子,其包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。7.如权利要求1所述的表达增强子,其包含选自SEQ ID NO:24、27、68、69、70和71的核苷酸序列。8.如权利要求2所述的表达增强子,其包含选自SEQ ID NO:72、73、74、75、76和77的核苷酸序列。9.植物表达系统,其包含含有调控区和目标核苷酸序列的核酸序列,所述调控区与权利要求1所述的表达增强子可操作地连接。10.如权利要求9所述的植物表达系统,其还包含豇豆花叶病毒属3’UTR。11.如权利要求9所述的植物表达系统,其还包含第二核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员:皮埃尔奥利维耶·拉瓦伊马克安德烈·蒂奥斯特
申请(专利权)人:莫迪卡戈公司
类型:发明
国别省市:加拿大;CA

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