一种人体氧化低密度脂蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法技术

一种人体氧化低密度脂蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。本发明专利技术属于体外检测诊断试剂领域，具体涉及一种人体内的Ox‑LDL含量测定的试剂盒及制备与应用。其包括固相化有特异性结合氧化低密度脂蛋白新型配体结构的重组蛋白P.rβ2‑GPI‑DV或E.coli重组蛋白rβ2‑GPI‑DV的酶标板、不同浓度的氧化低密度脂蛋白标准对照样品、质控品、酶标记的抗体、稀释液、清洗液、显色液A、显色液B和终止液。本发明专利技术所使用的酵母重组蛋白P.rβ2‑GPI‑DV或E.coli重组蛋白rβ2‑GPI‑DV通过结合oxLDL新型配体识别位点检测的Ox‑LDL是具有致动脉粥样硬化、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病炎症反应的致病性Ox‑LDL，对于伴有动脉粥样硬化、脂质代谢异常以及炎症反应特质的疾病的精准辅助诊断具有应用价值，本发明专利技术所用检测仪器简单，检测成本低，非专业人员即可实现检测操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于体外检测诊断试剂领域，具体涉及一种人体内的氧化低密度脂蛋白Ox-LDL含量检测的试剂盒及制备与应用。
技术介绍
低密度脂蛋白LDL是一种存在于血浆中的载脂蛋白，核心组分是甘油三酯和胆固醇脂,表面分布着载脂蛋白aPO-B、游离胆固醇和磷脂。在体内活性氧、细胞、过渡金属、铜蓝蛋白、过氧化物酶、血红素、叶绿素以及外界一些敏感因素如，吸烟、药物、糖尿病和高血压等的氧化修饰作用下形成Ox-LDL。在ox-LDL氧化衍生物中氧化磷脂、氧化固醇及修饰改变的apoB抗体是其发挥致病性的关键因素。众多研究指向oxLDL是引发动脉粥样硬化、心血管疾病、自身免疫性心血管疾病及非酒精性脂肪肝病肝炎的生物标记物。Ox-LDL作为动脉粥样硬化剂心血管疾病的独立危险因子，广泛存在于疾病病灶及患者血液中，通过引起内皮损伤、血管壁增厚、脂质沉积、血酸形成等系列病例改变贯穿于整个疾病的病程；近年研究发现，自身免疫性疾病中的抗磷脂综合症(APS)及系统性红斑狼疮(SLE)患者血液中含有大量的Ox-LDL，可与血液中的糖蛋白β2-GPI、抗β2-GPI抗体形成免疫三元复合物，发挥促泡沫细胞形成的病理机制，参与动脉粥样硬化灶的形成[1,2]，近年研究更加显示oxLDL可能是脂肪肝尤其是非酒精性脂肪肝肝病中引发氧化应激、炎症后导致肝炎的脂质代谢危险因子因此，人血液、血清以及体液等Ox-LDL含量的准确检测对心血管疾病及脂代谢障碍性疾病的预防、监测及早期诊断意义重大。目前，现有技术中，已经公开了一些相关的检测方法，通过半定量或定量的方式实现Ox-LDL检测，如：专利申请号为：200710202084.7，201210160797.2，201510263037.8，以上公开的专利技术技术中，检测所使用的关键包被固相主体是抗氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体。然而氧化低密度脂蛋白oxLDL在血液和病灶间的流动性及氧化修饰程度、氧化修饰衍生物成份复杂的特点，oxLDL在体内以成份不均一的复合物形式存在，其氧化修饰衍生物是其发挥致病新的关键因素，如何准确达到识别致病oxLDL的氧化衍生物配体，达到精准检测oxLDL及对动脉粥样硬化、心血管疾病、自身免疫性APS和SLE以及非酒精性脂肪肝等疾病发展进程中的辅助应用是本专利技术的目的。
技术实现思路
本专利技术的技术方案提供了一种可以特异性结合致巨噬细胞泡沫化以及产生炎症因子的致
病性Ox-LDL检测的新技术，这项技术的核心是一种酵母表达P.rβ2-GPI–DV重组蛋白特异识别致病性oxLDL表面配体，该表面配体具有介导致病性oxLDL激发巨噬细胞和肝细胞等表面受体和胞内受体，引发细胞脂质代谢的异常变化导致动脉粥样硬化、心血管和脂质代谢等疾病发生。该专利技术技术检测原理清晰，操作简单、涉及的实验仪器单一、价格低廉以及具有精准检测oxLDL识别位点的特质，是临床心血管疾病、伴发动脉粥样硬化自身免疫性疾病及脂代谢障碍性疾病诊断有价值的辅助诊断检测试剂盒。一种人体氧化低密度脂蛋白oxLDL的酶联免疫检测试剂盒，包括固相化有特异性结合oxLDL的重组蛋白的酶标板、不同浓度的oxLDL标准对照样品、质控品、酶标记的抗体、稀释液、清洗液、显色液A、显色液B和终止液。进一步的，所述的酶标板为聚苯乙烯的96微孔板；所述的固相化的特异性重组蛋白为酵母重组表达的P.rβ2-GPI-DV蛋白；所述的酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗人的抗apoB抗体；所述的稀释液为磷酸盐缓冲液；所述的清洗液为含有吐温20的磷酸盐缓冲液；所述的显色液A为过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液；所述的显色液B为邻苯二胺(OPD)溶液；所述的终止液为硫酸溶液。进一步的，所述试剂盒微孔板上固相化的重组蛋白的样品量为50ug/孔；所述的氧化低密度脂蛋白oxLDL标准对照品为6支、各2ml；所述的质控品5ml、2支；所述的辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗apoB抗体1支、10ul；所述稀释液10ml、1支；所述清洗液50ml，1支；所述的显色液A5ml、1支，显色液B 10ml、1支；所述的终止液10ml、1支。进一步的，所述的氧化低密度脂蛋白oxLDL标准对照品均为氧化低密度脂蛋白的纯品与氧化低密度脂蛋白标准品稀释液按照比例稀释而成。所述质控品和标准对照品的区别只是浓度不同，所述质控品的设立目的是通过质控品检测值是否在质控范围内来对标准品拟合曲线进行核准校对，若质控品合格，则可用标准曲线对检测样品进行拟合计算样品中氧化低密度脂蛋白的浓度，若质控品不合格，则试剂盒无法准确进行检测拟合。进一步的，所述的氧化低密度脂蛋白标准品稀释液是在PH 7.4的磷酸盐缓冲液中，分别加入5％的蔗糖及1U、2U、4U、8U、16U的氧化低密度脂蛋白；所述的氧化低密度脂蛋白质控品是0.5U和20U的氧化低密度脂蛋白纯品；所述的1U定义为25μg。进一步的，所述的稀释液是PH7.4的磷酸盐缓冲液；所述的清洗液是每升含5ml的吐温20；所述的显色液A是在1M的柠檬酸盐溶液中加入质量分数为1％的30％的过氧化氢；显色液B是每升中含有10ug的OPD水溶液；所述的终止液是2N的浓硫酸溶液。制备如上任意所述的试剂盒方法，包括以下制备方法，不分前后顺序：特异性结合氧化低密度脂蛋白oxLDL的P.rβ2-GPI-DV重组蛋白的制备：将目的基因重组到X-33的酵母重组表达菌株中，在甲醇诱导下产生重组表达蛋白rβ2-GPI-DV，镍柱亲和层析获得纯化蛋白冻干成粉后于-80℃保存；氧化低密度脂蛋白纯品的制备：取低密度脂蛋白，溶解于1M的磷酸盐缓冲液中，低密度脂蛋白的浓度为1mg/ml；在此溶液中加入硫酸铜，使其终含量为1％，37℃；8h。固相化有重组蛋白微孔板的制备：将浓度为1mg/ml的特异性结合氧化低密度脂蛋白的重组蛋白P.rβ2-GPI-DV用PH9.6浓度1M碳酸盐缓冲液稀释到浓度为50ug/ml，加入到微孔板中50ul/孔，4℃固相化12h；然后使用清洗液清洗微孔板4次，每次振摇2min；倾去包被液，甩干板，再向微孔板中加入1％gelatin溶液，200ul/孔进行37℃，1h封闭；倾去封闭液，等待微孔板干燥后，加入干燥剂的真空袋封装，既得到固相化有重组蛋白的酶标板，置于4℃保存。氧化低密度脂蛋白对照标准品和质控品的制备：(1)氧化低密度脂蛋白纯品的制备：①.取准确浓度(100ug/ml)的低密度脂蛋白一定体积数量(过滤灭菌)，加入到灭菌培养瓶中；②.加入500uMCuSO4·5H2O,使其终浓度达到5uM(过滤灭菌)；③.再加入1M的磷酸盐缓冲液(PBS，过滤灭菌)，加入的体积分数为89％；培养瓶盖半松情况下，37℃，孵育8h。在孵育4h后拿出培养瓶摇晃一下后继续孵育至8h；④.孵育8h后加入硫酸铜体积一半量的EDTA终止氧化；⑤.将终止氧化的氧化液装入准备好的透析袋中(100℃沸水煮3次，3min/次)；⑥.放入透析液中(含有0.5％200mM EDTA的1M磷酸盐缓冲液)；⑦.将透析袋及透析液放入4℃环境下，每4h更换一次透析液，更换5次；⑧.完成透析后将透析袋中的液体经超滤管浓缩、TBARS、BCA测定后过滤灭菌4℃保存；(2)氧化低密度脂蛋白标准品的制备：标准品1：含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人体氧化低密度脂蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，其包括固相化有特异性结合氧化低密度脂蛋白的重组蛋白的酶标板、不同浓度的氧化低密度脂蛋白标准对照样品、质控品、酶标记的抗体、稀释液、清洗液、显色液A、显色液B、终止液；其中，固相化有特异性结合氧化低密度脂蛋白的重组蛋白的酶标板中的酶标板为聚苯乙烯的96微孔板、固相化的特异性重组蛋白为酵母重组表达的重组蛋白P.rβ2‑GPI‑DV或E.coli重组蛋白rβ2‑GPI‑DV，试剂盒微孔板上固相化的重组蛋白的数量为50ug/孔；质控品为含有5％蔗糖的0.5U和20U的氧化低密度脂蛋白纯品各2支，每支5ml，其中1U定义为2.5ug；酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗apoB抗体，辣根过氧化物酶标记的抗apoB抗体为1支、10ul；不同浓度的氧化低密度脂蛋白标准对照样品为6支、各2ml，氧化低密度脂蛋白标准对照品均为氧化低密度脂蛋白的纯品与氧化低密度脂蛋白标准品稀释液按照0U、1U、2U、4U、8U、16U稀释而成，，氧化低密度脂蛋白标准品稀释液是在PH 7.4的磷酸盐缓冲液中，分别加入5％的蔗糖及1U、2U、4U、8U、16U的氧化低密度脂蛋白，1U定义为25μg；稀释液为是PH7.4的磷酸盐缓冲液，10ml、1支；清洗液为每升含5ml吐温20的磷酸盐缓冲液，50ml，1支；显色液A是在1M的柠檬酸盐溶液中加入质量分数为1％的30％的过氧化氢，5ml、1支；显色液B是每升中含有10ug的OPD水溶液，10ml、1支；终止液是2N的浓硫酸溶液，10ml、1支。...

【技术特征摘要】
1.一种人体氧化低密度脂蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，其包括固相化有特异性结合氧化低密度脂蛋白的重组蛋白的酶标板、不同浓度的氧化低密度脂蛋白标准对照样品、质控品、酶标记的抗体、稀释液、清洗液、显色液A、显色液B、终止液；其中，固相化有特异性结合氧化低密度脂蛋白的重组蛋白的酶标板中的酶标板为聚苯乙烯的96微孔板、固相化的特异性重组蛋白为酵母重组表达的重组蛋白P.rβ2-GPI-DV或E.coli重组蛋白rβ2-GPI-DV，试剂盒微孔板上固相化的重组蛋白的数量为50ug/孔；质控品为含有5％蔗糖的0.5U和20U的氧化低密度脂蛋白纯品各2支，每支5ml，其中1U定义为2.5ug；酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗apoB抗体，辣根过氧化物酶标记的抗apoB抗体为1支、10ul；不同浓度的氧化低密度脂蛋白标准对照样品为6支、各2ml，氧化低密度脂蛋白标准对照品均为氧化低密度脂蛋白的纯品与氧化低密度脂蛋白标准品稀释液按照0U、1U、2U、4U、8U、16U稀释而成，，氧化低密度脂蛋白标准品稀释液是在PH 7.4的磷酸盐缓冲液中，分别加入5％的蔗糖及1U、2U、4U、8U、16U的氧化低密度脂蛋白，1U定义为25μg；稀释液为是PH7.4的磷酸盐缓冲液，10ml、1支；清洗液为每升含5ml吐温20的磷酸盐缓冲液，50ml，1支；显色液A是在1M的柠檬酸盐溶液中加入质量分数为1％的30％的过氧化氢，5ml、1支；显色液B是每升中含有10ug的OPD水溶液，10ml、1支；终止液是2N的浓硫酸溶液，10ml、1支。2.根据权利要求1所述的一种人体氧化低密度脂蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，其制备方法为：(1)氧化低密度脂蛋白纯品的制备：①.取准确浓度的低密度脂蛋白一定体积数量，加入到灭菌培养瓶中；②.加入500uMCuSO4·5H2O,使其终浓度达到5uM；③.再加入1M的磷酸盐缓冲液(PBS)，加入的体积分数为89％；培养瓶盖半松情况下，37℃，孵育8h，在培养4h后拿出培养瓶摇晃一下；④.孵育8h后加入硫酸铜体积一半量的EDTA终止氧化；⑤.将终止氧化的氧化液装入准备好的透析袋中，100℃沸水煮3次，3min/次；⑥.放入透析液中，透析液为含有0.5％200mMEDTA的1M磷酸盐缓冲液；⑦.将透析袋及透析液放入4℃环境下，每4h更换一次透析液，更换5次；⑧.完成透析后将透析袋中的液体经超滤管浓缩、TBARS、BCA测定后4℃保存；(2)氧化低密度脂蛋白标准品的制备：标准品1：含有5％的蔗糖；标准品2：含有5％的蔗糖，1U/ml的氧化低密度脂蛋白纯品；标准品3：含有5％的蔗糖，2U/ml的氧化低密度脂蛋白纯品；标准品...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆平，张鹤，李敬达，王仁军，
申请(专利权)人：刘庆平，
类型：发明
国别省市：辽宁;21