编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸分子的组合物、制备方法、生产和治疗性用途，所述低密度脂蛋白受体包含至少一个突变(例如，LDLR信号增强性突变)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年9月18日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号62/052,139、2014年3月14日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号61/952,906、2013年10月3日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号61/886,137和2013年11月13日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号61/903,485的优先权，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。序列表的引用本申请随电子格式的序列表一起提交。该序列表作为2014年10月3日创建、大小2,607,599比特、名为M070PCT.txt的文件提供。电子格式的序列表中的信息通过引用的方式完整并入本文。
本专利技术涉及用于设计，制备、制造和/或配制多核苷酸的组合物、方法、过程、试剂盒和装置，所述多核苷酸编码低密度脂蛋白受体，所述低密度脂蛋白受体包含至少一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。
技术介绍
高胆固醇是心脏病发作和卒中的众多风险因素之一。尽管饮食不良和缺少锻炼是高胆固醇的常见原因，但是遗传改变，如由LDLR缺乏引起的家族性高胆固醇血症(FH)，可能是高胆固醇的原因。目前市场上有众多降胆固醇药物，但是它们并非没有风险或在某些情况或其他药物情况下并非没有禁忌。这类药物包括他汀类、贝特类、烟酸、胆汁酸螯合剂(树脂)、植物甾醇或阻止脂肪吸收、减少胆固醇吸收或靶向胆固醇运输途径中诸基因的其他化合物。基于核酸的降胆固醇药物包括，例如靶向ApoB-100的反义寡核苷酸抑制剂，米泊美生(mipomersen)，其在2013年1月获批用于治疗纯合家族性高胆固醇血症(FH)。在2012年12月，FDA还批准洛美他派用于同一病症。更麻烦之处是与靶向胆固醇的药物相关的肝相关问题，尤其血清氨基转移酶升高和肝脂肪蓄积(或肝脂肪变性)。例如，因为围绕泊美生的潜在明显安全顾虑，该药物将附带关于肝毒性以及需要处方者和药房证明的加框警告，以及该药物应当随每张新处方恰当使用的文件记录。尽管米泊美生总体上有效降低LDL胆固醇(临床试验中超过半数的患者具有超过20％的LDL水平下降并且在纯合FH试验中，它降低LDL24.7％)，但是一般FH患者具有400-1000mg/dL之间的平均LDL。因此，降低作用在这些患者中可能不充分。此外，这些试验并不大到足以有把握评估心血管结果，尽管心血管益处当然是该药物的最终预期作用。另外，在III期试验的米泊美生组中出现心脏病患的严重不良事件。本专利技术通过提供编码目的多肽的多核苷酸解决了LDLR降解问题，所述目的多肽包含至少一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。本专利技术通过提供具有避免本领域一个或多个问题的结构特征和/或化学特征的基于核酸的化合物或多核苷酸(编码性和非编码性及其组合)，解决了这种需求，所述特征例如可用于优化基于核酸的治疗药，同时保留结构和功能完整性，克服表达阈值，改善表达速率、半寿期和/或蛋白质浓度，优化蛋白质定位，并且避免有害生物反应如免疫反应和/或降解途径。可以使用本专利技术减少或消除这些屏障。专利技术概述本文中描述了用于设计，制备、制造和/或配制多核苷酸的组合物、方法、过程、试剂盒和装置，所述多核苷酸编码低密度脂蛋白受体(LDLR)，所述低密度脂蛋白受体包含至少一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。在一个非限制性实施方案中，这类多核苷酸采取修饰的mRNA分子的形式或作为修饰的mRNA分子发挥作用，所述修饰的mRNA分子编码一种或多种肽或目的多肽。在一个实施方案中，这类多核苷酸是基本上非编码的。本文中提供编码LDLR的多核苷酸。在一个方面，多核苷酸包含至少一个在本文公开的化学修饰的核苷，如天然存在和非天然存在的核苷。在一个实施方案中，本文中提供用于表达LDLR的多核苷酸，例如，IVT多核苷酸，所述多核苷酸包含连接的核苷的第一区域、相对于第一区域位于5’的第一侧翼区和相对于第一区域位于3’的第二侧翼区。第一区域可以编码目的多肽，编码LDLR，如，但不限于SEQ ID NO:37-55。连接的核苷的第一区域可以至少包含核酸序列的开放阅读框，如，但不限于，SEQ ID NO:56-718。在一个实施方案中，本文中提供用于表达LDLR的多核苷酸，例如，IVT多核苷酸，所述多核苷酸包含连接的核苷的第一区域、相对于第一区域位于5’的第一侧翼区和相对于第一区域位于3’的第二侧翼区。第一区域可以编码目的多肽，编码LDLR，如，但不限于SEQ ID NO:37-55。连接的核苷的第一区域可以至少包含核酸序列的开放阅读框，如，但不限于，SEQ ID NO:56-718。在一个实施方案中，多核苷酸例，如本文所述的IVT多核苷酸，可以编码目的多肽，所述目的多肽包含至少两个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。突变可以位于胞内结构域、EGF-A结构域上或位于胞内结构域和EGF-A结构域两者上。作为一个非限制性例子，目的多肽包含在胞内结构域上的两个突变，如K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽包含在胞内结构域上的三个突变，如K816R、K830R和C839A。在另一个实施方案中，多核苷酸例，如本文所述的IVT多核苷酸，可以编码目的多肽，所述目的多肽包含在EGF-A结构域上的一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变，和在胞内结构域上的至少两个突变。在EGF-A结构域上的突变可以是，但不限于，N316A和L339D，并且在胞内结构域上的突变可以是，但不限于K816R、K830R和C839A。作为一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变N316A和在胞内结构域上的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变N316A和在胞内结构域上的突变K816R、K830R和C839A。作为一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变L339D和在胞内结构域上的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变L339D和在胞内结构域上的突变K816R、K830R和C839A。在一个实施方案中，第一侧翼区可以包含连接的核苷的序列，所述序列具有5’非翻译区(UTR)的特性，如，但不限于，编码SEQ ID NO:37-55、SEQ ID NO:3-19和其功能性变体中任一者的任意核酸的天然5′UTR。在一个方面，第一侧翼区可以是结构化UTR。第一侧翼区还可以包含至少一个5′末端帽，如，但不限于帽0(Cap0)、帽1(Cap1)、ARCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的多核苷酸，其中所述LDLR包含在选自EGF‑A结构域、胞内结构域以及所述EGF‑结构域和胞内结构域两者的结构域中的至少一个突变，其中，所述多核苷酸包含；(a)连接的核苷的第一区域，所述第一区域编码目的多肽，所述目的多肽选自SEQ ID NO:37‑55和724‑729；(b)第一侧翼区，其相对于所述第一区域位于5’，包含至少一个5’末端帽；(c)第二侧翼区，其相对于所述第一区域位于3’，包含连接的核苷的加尾序列；并且其中所述多核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.03 US 61/886,137;2013.11.13 US 61/903,485;1.编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的多核苷酸，其中所述LDLR包含在选自EGF-A结构域、胞内结构域以及所述EGF-结构域和胞内结构域两者的结构域中的至少一个突变，其中，所述多核苷酸包含；(a)连接的核苷的第一区域，所述第一区域编码目的多肽，所述目的多肽选自SEQ ID NO:37-55和724-729；(b)第一侧翼区，其相对于所述第一区域位于5’，包含至少一个5’末端帽；(c)第二侧翼区，其相对于所述第一区域位于3’，包含连接的核苷的加尾序列；并且其中所述多核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中连接的核苷的第一区域至少包含核酸序列的开放阅读框，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:56-718和732-737。3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述目的多肽包含至少两个突变。4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述至少两个突变位于所述胞内结构域内。5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述两个突变选自K816R、K830R和C839A。6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述两个突变是K830R和C839A。7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述目的多肽包含在所述胞内结构域中的三个突变，并且所述三个突变是K816R、K830R和C839A。8.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述目的多肽包含在所述EGF-A结构域中的一个突变和在所述胞内结构域中的至少两个突变。9.根据权利要求8所述的多核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰夫·L·埃尔斯沃思，J·B·博伦，F·M·格雷瓜尔，贾斯汀·基尔德，
申请(专利权)人：现代治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US