一种邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的分离筛选方法技术

一种邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的分离筛选方法，取垃圾场附近的土壤5g，加入250mL的无机盐培养基，再加入DMP溶液10mL，驯化10天；制作DMP‑MSM固体平板培养基；涂布菌液；制作DMP‑MSM液体培养基，观察固体平板培养基表面，对于已经生长的菌落进行选择性挑菌，即随机选择20个或更多数量的不同平板生长的单菌落，用接种针将这些菌落挑出，转接入DMP‑MSM液体培养基中，每个单菌落接种一瓶液体培养基，在恒温摇床培养箱中避光、30℃、100r/min培养48h；对20个或更多数量的已培养48h的培养基，进行显微镜观察，对于长出大量微生物的液体培养基重复进行固体—液体混合连续培养，直到显微观察的微生物形态一致，或经分子生物学方法鉴定确定为纯菌种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种邻苯二甲酸二甲酯(DMP)降解微生物的分离筛选方法，属于微生物的分离筛选方法

技术介绍
常用的微生物分离筛选方法主要包括平板划线法和平板涂布法，目前国内外分离筛选邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的方法也不例外都使用这两种方法。一般的流程是：首先是从特定的环境中采样，比如淤泥、土壤或者特殊的受污染环境等，驯化后，直接取菌悬液涂布与含有邻苯二甲酸二甲酯的固体平板培养基的表面进行培养，待长出菌落后，进行多次平板划线分离纯化菌种，最终得到一株纯的目的微生物。这样的筛选方法如果应用在其他微生物的筛选过程中是很合适的，成功的案例也比比皆是。但是由于邻苯二甲酸二甲酯是一种难溶的有机化合物，在制作固体平板培养基时，所有加入的邻苯二甲酸二甲酯都沉淀到了平板的底部，而我们进行涂布和划线培养，所利用的培养基都是最上层的那一小部分，这样在上面接种的微生物基本不能接触到邻苯二甲酸二甲酯，涂布或划线接种的微生物不能利用邻苯二甲酸二甲酯作为唯一碳源，而是利用琼脂作为营养成分，最终也就不能筛选到邻苯二甲酸二甲酯降解微生物。很多时候，为了筛选到邻苯二甲酸二甲酯降解微生物，现有的办法只能延长驯化时间，例如30d、60d或更长时间，使得在驯化这一步骤中，富集更多的目的微生物，减少杂菌的数量。在后续的平板涂布和划线过程中，由于接种的细菌基本都是邻苯二甲酸二甲酯降解微生物，所以也可以筛选到目的微生物。但是，这种筛选方法，由于固体平板培养基中不含有邻苯二甲酸二甲酯(沉淀的原因)，经多次纯化后，降解特性逐渐消
失，最终得到的微生物已无降解功能，不得不重复驯化和筛选，直到最终筛选出一株有降解活性的邻苯二甲酸二甲酯降解微生物。同时，长时间的驯化工作不仅枯燥乏味，也大大影响了实验进度，科研人员身心也会遭受很大的痛苦，这些都给科研工作带来太多不便。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述现有技术存在的问题，进而提供一种有效的邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的快速分离筛选方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的分离筛选方法，步骤如下：步骤一、取垃圾场附近的土壤5g，加入250mL的无机盐培养基(MSM)，再加入DMP(邻苯二甲酸二甲酯)溶液10mL，驯化10天。步骤二、制作DMP-MSM固体平板培养基：取无机盐培养基，加入2％的琼脂粉，高温蒸汽灭菌后，倒平板，待冷却凝固后，在每个平板培养基表面加入10mL的DMP溶液，避光室温(25℃)浸泡24h，然后将固体培养基表面未吸收的剩余DMP溶液用移液枪回收。步骤三、涂布菌液：取驯化好的土壤悬液100uL，均匀涂布在步骤二制作的DMP-MSM固体平板培养基表面，不倒置，在培养箱中避光、30℃条件下培养48h。步骤四、制作DMP-MSM液体培养基：取已灭菌的无机盐培养基10mL，加入100uLDMP溶液，再加入5μL吐温-80，使DMP溶液均匀的分散在无机盐培养基中，而不是沉淀到培养基底部。步骤五、观察已培养48h的固体平板培养基表面，对于已经生长的菌落进行选择性挑菌，即随机选择20个或更多数量的不同平板生长的单菌落，用接种针将这些菌落挑出，转接入步骤四制作的DMP-MSM液体培养基中，每个单菌落接种一瓶液体培养基，在恒温摇床培养箱中避光、30℃、100r/min条件下培养48h。步骤六、对步骤五的20个或更多数量的已培养48h的培养基，进行显微镜观察，对于长出大量微生物的液体培养基进行后续的菌种分离纯化。步骤七、微生物的分离纯化：将步骤六中长出大量微生物的液体培养基取出100uL，按照步骤三中的方法，涂布到步骤二中的DMP-MSM固体培养基表面；重复步骤三至步骤六的实验步骤进行固体——液体连续混合培养，直到显微观察的微生物形态一致，或经分子生物学方法鉴定确定为纯菌种。本专利技术的有益效果：本专利技术设计了一整套用于分离筛选邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的方法。通过使用本专利技术的分离筛选方法，能够快速、有效的分离筛选到邻苯二甲酸二甲酯降解微生物。在本专利技术中，制作DMP-MSM固体培养基时应用了DMP浸泡法来克服DMP沉淀的问题，这样在涂布和划线平板时，所接种的微生物都能充分的接触DMP，大大提高了分离筛选的效率。但是，仅仅使用平板涂布和平板划线法仍然有一定的概率使得筛选到的微生物不是目的微生物。为了能更准确的分离筛选到一株有降解活性的邻苯二甲酸二甲酯降解微生物，本专利技术中，在每次固体平板涂布培养之后，都进行了一次液体培养基培养，即将平板上长出的单菌落，分别接种到DMP-MSM液体培养基中，这样，如果在液体培养基有大量微生物繁殖，可以确定，它就是有降解活性的邻苯二甲酸二甲酯降解微生物。而在制作液体培养基时，业内普遍采用DMP直接加入到MSM培养基中的方法，虽然接种的微生物也能在这样的液体培养基中繁殖，但是由于DMP聚集沉淀，能接触到DMP的微生物非常少，结果造成液体培养基培养DMP降解菌的时间大大延长，一般培养一次的时间超过10d。所以为了解决DMP难溶于液体培养基和减少培养时间的问题，本专利技术中在液体培养基中加入微量的吐温-80，使得DMP均匀分散在MSM液体培养基中，这样就大大缩短了培养时间。上述这种“固体——液体”混合连续培养法解决了业内关于难溶有机沉淀物作为唯一营养物质的微生物的分离筛选过程中遇到的种种问题，成功的避免筛选到以琼脂作为
营养物质的微生物，并且大大缩短了分离筛选时间，尤其是分离筛选以邻苯二甲酸酯类物质作为唯一碳源的降解微生物，这种方法更适合。附图说明图1为60μL/L DMP标准溶液的HPLC测定结果示意图。图2为降解菌实验组剩余DMP的HPLC检测结果示意图。具体实施方式下面将对本专利技术做进一步的详细说明：本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本专利技术的保护范围不限于下述实施例。本实施例所涉及的一种邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的分离筛选方法，由以下步骤实施：步骤一、取垃圾场附近的土壤5g，加入250mL的无机盐培养基，再加入DMP(邻苯二甲酸二甲酯，一种塑化剂)溶液10mL，驯化10天；所述无机盐培养基(MSM)配方如下：A，大量元素溶液：NH4NO3、2g；MgSO4·7H2O、0.5g；NaCl、0.5g；K2HPO4·3H2O、2g；KH2PO4、0.4g和H2O、1000mL。B，微量元素溶液：FeSO4·7H2O、300mg；CoCl2·6H2O、100mg；ZnSO4·7H2O、80mg；CaCl2、100mg和H2O、1000mL。使用前，取B溶液2mL加入到A溶液中，调pH值为6.5。所述步骤一的驯化过程：将待驯化的土壤溶液置于500mL灭菌三角瓶中，用灭菌棉塞封口，将三角瓶放置于避光的恒温摇床培养箱中，培养温度30℃，100r/min摇瓶，连续驯化10天。步骤二、制作DMP-MSM固体平板培养基：取无机盐培养基，加入2％的琼脂粉，高温蒸汽灭菌后，倒平板，待冷却凝固后，在每个平板培养基表面加入10mL的DMP
溶液，避光室温(25℃)浸泡24h，然后将固体培养基表面未吸收的剩余DMP溶液用移液枪回收。所述步骤二中高温蒸汽灭菌的条件：121℃，灭菌25min。所述步骤二倒平板的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的分离筛选方法，其特征在于，步骤一、取垃圾场附近的土壤5g，加入250mL的无机盐培养基，再加入DMP溶液10mL，驯化10天；步骤二、制作DMP‑MSM固体平板培养基：取无机盐培养基，加入2％的琼脂粉，高温蒸汽灭菌后，倒平板，待冷却凝固后，在每个平板培养基表面加入10mL的DMP溶液，避光室温浸泡24h，然后将固体培养基表面未吸收的剩余DMP溶液用移液枪回收；步骤三、涂布菌液：取驯化好的土壤悬液100uL，均匀涂布在步骤二制作的DMP‑MSM固体平板培养基表面，不倒置，在培养箱中避光、30℃条件下培养48h；步骤四、制作DMP‑MSM液体培养基：取已灭菌的无机盐培养基10mL，加入100uLDMP溶液，再加入5μL吐温‑80，使DMP溶液均匀的分散在无机盐培养基中；步骤五、观察已培养48h的固体平板培养基表面，对于已经生长的菌落进行选择性挑菌，即随机选择20个或更多数量的不同平板生长的单菌落，用接种针将这些菌落挑出，转接入步骤四制作的DMP‑MSM液体培养基中，每个单菌落接种一瓶液体培养基，在恒温摇床培养箱中避光、30℃、100r/min条件下培养48h；步骤六、对步骤五的20个或更多数量的已培养48h的培养基，进行显微镜观察，对于长出大量微生物的液体培养基进行后续的菌种分离纯化；步骤七、微生物的分离纯化：将步骤六中长出大量微生物的液体培养基取出100uL，按照步骤三中的方法，涂布到步骤二中的DMP‑MSM固体培养基表面；重复步骤三至步骤六的实验步骤进行固体——液体连续混合培养，直到显微观察的微生物形态一致，或经分子生物学方法鉴定确定为纯菌种。...

【技术特征摘要】
1.一种邻苯二甲酸二甲酯降解微生物的分离筛选方法，其特征在于，步骤一、取垃圾场附近的土壤5g，加入250mL的无机盐培养基，再加入DMP溶液10mL，驯化10天；步骤二、制作DMP-MSM固体平板培养基：取无机盐培养基，加入2％的琼脂粉，高温蒸汽灭菌后，倒平板，待冷却凝固后，在每个平板培养基表面加入10mL的DMP溶液，避光室温浸泡24h，然后将固体培养基表面未吸收的剩余DMP溶液用移液枪回收；步骤三、涂布菌液：取驯化好的土壤悬液100uL，均匀涂布在步骤二制作的DMP-MSM固体平板培养基表面，不倒置，在培养箱中避光、30℃条件下培养48h；步骤四、制作DMP-MSM液体培养基：取已灭菌的无机盐培养基10mL，加入100uLDMP溶液，再加入5μL吐温-80，使DMP溶液均匀的分散在无机盐培养基中；步骤五、观察已培养48h的固体平板培养基表面，对于已经生长的菌落进行选择性挑菌，即随机选择20个或更多数量的不同平板生长的单菌落，用接种针将这些菌落挑出，转接入步骤四制作的DMP-MSM液体培养基中，每个单菌落接种一瓶液体培养基，在恒温摇床培养箱中避光、30℃、100r/min条件下培养48h；步骤六、对步骤五的20个或更多数量的已培养48h的培养基，进行显微镜观察，对于长出大量微生物的液体培养基进行后续的菌种分离纯化；步骤七、微生物的分离纯化：将步骤六中长出大量微生物的液体培养基取出100uL，按照步骤三中...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫继先，李珊珊，王志刚，谭诗逸，于志丹，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23