一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法技术

本发明专利技术公开了一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法，以D‑半乳糖制备亚急性衰老小鼠模型，采用小鼠避暗法记录小鼠的学习记忆功能，测定脾脏指数、肝组织中单胺氧化酶MAO、血清中超氧化物歧化酶SOD及丙二醛MDA的活性，Western blot检测脑组织P53、P21蛋白的表达。本发明专利技术发现，赶黄草水提浓缩液组能改善其学习及记忆能力，揭示其具有明显的抗衰老作用，能增强机体免疫功能，还能升高衰老模型小鼠血清中SOD水平，降低MDA、MAO含量，具有一定的抗氧化作用，能明显下调脑组织中P21、P53的蛋白表达，呈现一定的剂量依赖性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物实验领域，尤其涉及一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法。
技术介绍
赶黄草(Penthorum chinense Pursh)学名扯根菜，又名水杨柳、水泽兰，为虎耳草科(saxifraganceae)扯根菜属扯根菜的地上部分，是四川泸州古蔺出产的一种苗家药材。始载于明代《救荒本草》，现载于《中药大辞典》、《全国中草药汇编》、《四川中药志》、《湖南药物志》、《内蒙古植物药志》等。民间以全草入药，性温，味甘，无毒，具有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、退黄、平肝的功效，可治经闭、水肿、血崩、带下、跌打损伤。现代研究表明赶黄草含多种有效成份均对肝损伤具保护作用，并对甲肝、乙肝、慢性活动性肝炎具有一定的治疗作用。苗家人以其草入药，可以解肝火、排肝毒、具有清除氧自由基，延缓衰老作用。在这种理论的指导下，本专利技术研究了赶黄草水提浓缩液抗衰老、增强免疫功能、清除自由基等作用及对细胞衰老信号通路P53/P21蛋白表达的影响，为赶黄草在新食品原料中的开发应用提供科学的实验依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法，旨在研究赶黄草水提浓缩液抗衰老、增强免疫功能、清除自由基作用及对细胞衰老信号通路P53/P21蛋白表达的影响。本专利技术是这样实现的，一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法以D-半乳糖制备亚急性衰老小鼠模型，采用小鼠避暗法记录小鼠的学习记忆功能，测定脾脏指数、肝组织中单胺氧化酶MAO、血清中超氧化物歧化酶SOD及丙二醛MDA的活性，Western blot检测脑组织P53、P21蛋白的表达。进一步，赶黄草水提浓缩液的制备方法如下：称取10kg赶黄草，粉碎粗粉，加蒸馏水100L，加热至80～90℃，浸泡提取30～60min，过滤，收集浸泡提取液，残渣加蒸馏水100L，加热至80～90℃浸泡提取30～60min，过滤，合并浸泡提取液，将浸泡提取液在60～70℃减压浓缩至5L得水赶黄草提浓缩液，该浓缩液浓度为赶黄草生药2g/mL。进一步，赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法具体包括：步骤一、分组及造模，将50只小鼠适应性喂养1周后，按体质量序随机分组，除空白对照组外，其他各组均每天颈背部皮下注射5％D-半乳糖生理盐水溶液0.025mL/g，空白对照组每天颈背部皮下注射等容量的生理盐水，连续注射42d，造模同时开始灌胃给药，每日灌胃1次，连续42d；步骤二、避暗实验，记录5min内小鼠进入暗室的电击次数，作为学习获得成绩，24h后再次测验，记录第1次触电潜伏期即将小鼠放人明室开始计时，到第1次双足触电时间和5min内小鼠进入暗室的电击次数，作为记忆保持成绩；步骤三、脾脏指数的测定，行为学测试结束后，将小鼠称质量，摘眼球取血后，脱臼处死，取脾脏称质量，计算小鼠脾脏指数，即脾脏指数＝脾脏质量(mg)/小鼠体质量(10g)；步骤四、各组小鼠于行为学测试完毕后，摘取小鼠眼球取血约lmL，取血完毕后，脱臼处死小鼠，取小鼠肝组织，血液离心取血清、组织制成10％匀浆置于4℃冰箱储存备用，进行单胺氧化酶MAO、血清中超氧化物歧化酶SOD及丙二醛MDA的含量测定；步骤五、Western blot检测脑组织P53、P21蛋白的表达，取小鼠脑组织，研磨后PBS漂洗遍，加入组织裂解液，提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白含量，SDS-PAGE胶电脉，转膜后将PVDF膜进行封闭2h，P53或P21一抗1:1000稀释，孵育1h后，加入稀释辣根过氧化物酶HRP标记的二抗室温或4℃孵育1h,用Luminate crescendo western HRP Substrate显影液对膜进行预染，后在Bio-Rad凝胶成像系统内曝光显影，Image Lab 3.0软件分析。进一步，50只小鼠适应性喂养1周后，按体质量序随机分为5组：空白对照
组，模型对照组，赶黄草水提浓缩液低中高三个剂量组：0.167g赶黄草/Kg、0.334g赶黄草/Kg、0.668g赶黄草/Kg。避暗实验结果发现，赶黄草水提浓缩液组能降低衰老模型小鼠避暗的错误次数，改善其学习及记忆能力，揭示其具有明显的抗衰老作用。本专利技术发现，赶黄草水提浓缩液不仅升高衰老模型小鼠的脾脏指数，增强机体免疫功能，还能升高衰老模型小鼠血清中SOD水平，降低MDA、MAO含量，具有一定的抗氧化作用。因此，提高衰老小鼠的免疫功能和清除氧自由基是赶黄草水提浓缩液抗衰老的作用机制。Western blot检测结果表明，赶黄草水提浓缩液能明显下调脑组织中P21、P53的蛋白表达，呈现一定的剂量依赖性，揭示其能通过抑制细胞衰老信号通处p53/p21蛋白的高表达，从而提高衰老小鼠的免疫功能和清除氧自由基，延缓机体的衰老。附图说明图1是本专利技术实施例提供的赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的赶黄草水提浓缩液对衰老小鼠脾脏指数的影响(n＝10)结果；图3是本专利技术实施例提供的Western blot检测脑组织P21、P53蛋白表达结果图。具体实施方式为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。请参阅图1至图3：一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法，以D-半乳糖制备亚急性衰老小鼠模型，采用小鼠避暗法记录小鼠的学习记忆功能，测定脾脏指数、肝组织中单胺氧化酶MAO、血清中超氧化物歧化酶SOD及丙二醛MDA的活性，Western blot检测脑组织P53、P21蛋白的表达。进一步，赶黄草水提浓缩液的制备方法如下：称取10kg赶黄草，粉碎粗粉，加蒸馏水100L，加热至80～90℃，浸泡提取30～60min，过滤，收集浸泡提取液，残渣加蒸馏水100L，加热至80～90℃浸泡提取30～60min，过滤，合并浸泡提取液，将浸泡提取液在60～70℃减压浓缩至5L得水赶黄草提浓缩液，该浓缩液浓度为赶黄草生药2g/mL。考马斯亮兰(批号20140324)、丙二醛(MDA，批号20140427)、超氧化物歧化酶(SOD，批号201400122)、单胺氧化酶(MAO，批号20140531)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。ECL Plus超敏发光、RIPA组织裂解液：碧云天生物技术研究所。一抗p21、一抗p53、β-actin：英国abcam公司。进一步，赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法具体包括：S101、分组及造模，将50只小鼠适应性喂养1周后，按体质量序随机分组，除空白对照组外，其他各组均每天颈背部皮下注射5％D-半乳糖生理盐水溶液0.025mL/g，空白对照组每天颈背部皮下注射等容量的生理盐水，连续注射42d，造模同时开始灌胃给药，每日灌胃1次，连续42d；S102、避暗实验，记录5min内小鼠进入暗室的电击次数，作为学习获得成绩，24h后再次测验，记录第1次触电潜伏期，即将小鼠放人明室开始计时，到第1次双足触电时间和5min内小鼠进入暗室的电击次数，作为记忆保持成绩；S103、脾脏指数的测定，行为学测试结束后，将小鼠称质量，摘眼球取血后，脱臼处死，取脾脏称质量，计算小鼠脾脏指数，脾脏指数＝脾脏质量(mg)/小鼠体质量(10g)；S104、各组小鼠于行为学测试完毕后，摘取小鼠眼球取血约本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法，其特征在于，所述赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法以D‑半乳糖制备亚急性衰老小鼠模型，采用小鼠避暗法记录小鼠的学习记忆功能，测定脾脏指数、肝组织中单胺氧化酶MAO、血清中超氧化物歧化酶SOD及丙二醛MDA的活性，Western blot检测脑组织P53、P21蛋白的表达。

【技术特征摘要】
1.一种赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法，其特征在于，所述赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法以D-半乳糖制备亚急性衰老小鼠模型，采用小鼠避暗法记录小鼠的学习记忆功能，测定脾脏指数、肝组织中单胺氧化酶MAO、血清中超氧化物歧化酶SOD及丙二醛MDA的活性，Western blot检测脑组织P53、P21蛋白的表达。2.如权利要求1所述的赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法，其特征在于，赶黄草水提浓缩液的制备方法如下：称取10kg赶黄草，粉碎粗粉，加蒸馏水100L，加热至80～90℃，浸泡提取30～60min，过滤，收集浸泡提取液，残渣加蒸馏水100L，加热至80～90℃浸泡提取30～60min，过滤，合并浸泡提取液，将浸泡提取液在60～70℃减压浓缩至5L得水赶黄草提浓缩液，该浓缩液浓度为赶黄草生药2g/mL。3.如权利要求1所述的赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法，其特征在于，赶黄草水提浓缩液抗衰老作用实验方法具体包括：步骤一、分组及造模，将50只小鼠适应性喂养1周后，按体质量序随机分组，除空白对照组外，其他各组均每天颈背部皮下注射5％D-半乳糖生理盐水溶液0.025mL/g，空白对照组每天颈背部皮下注射等容量的生理盐水，连续注射42d，造模同时开始灌胃给药，每日灌胃1次，连续42d；步骤二、避暗实验，记录5min内小鼠进入暗室的电击次数，作为学习获得成绩，24h后再次测验，记录第1次触...

【专利技术属性】
技术研发人员：税丕先，刘明华，朱烨，刘中飞，孙琴，李婷，
申请(专利权)人：西南医科大学，
类型：发明
国别省市：四川;51