CYP450受不可逆抑制的微粒体及其在代谢途径的酶表型分析中的用途制造技术

制备包含受不可逆抑制的细胞色素P450(CYP450)的分离的微粒体的方法。分离的微粒体的特征在于其细胞色素P450受非可逆抑制剂的不可逆抑制。本发明专利技术的分离的微粒体在候选药物酶促反应表型分析方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术属于在新药的情况下，用于评价药物相互作用的产品和方法的研究和开发领域。本专利技术涉及制备具体人细胞色素P450(CYP450)受不可逆抑制的分离的微粒体的方法，该微粒体将用于定量该酶对活性成分代谢的贡献。药物的有效性和毒性可因施用另一化合物(药物、环境污染物、食物)而改变。这些是药物相互作用(DDI；药物-药物相互作用)。存在不同类型的相互作用机制，最重要的是代谢性相互作用，其属于药物代谢动力学相互作用。代谢性药物相互作用尤其理解为这样的事实，药物A可以通过加速药物B的代谢(激活或诱导)或通过减少药物B的代谢(抑制或阻遏)，来改变共同施用的药物B的代谢。在新药开发项目中，此代谢性药物相互作用使得有必要一方面鉴定参与活性成分代谢的酶，另一方面鉴定该活性成分的潜在抑制剂或诱导剂。肝是代谢药物的主要部位。肝细胞包含关键代谢酶，包括细胞色素P450(CYP450)。细胞色素P450因此构成药物相互作用预测中的主要靶标。为了预测药物相互作用的风险，有必要鉴定和测定每种酶对活性成分代谢的贡献；这就是酶促反应的表型分析。为了估计每种酶对活性成分代谢的贡献，可以利用对代谢途径进行表型分析的多种方法。一系列经表征的人肝微粒体的使用可以辅助鉴定参与活性成分代谢的酶。此方法需要预先表征来自至少15个单批次获自人肝的微粒体的主要CYP450的酶活性。将15个批次微粒体中的每一个与活性成分孵育，以确定其代谢速率和那些同一微粒体的每种细胞色素P450的活性之间的相关
性。但是，微粒体系列的使用不允许定量测定所涉及的酶，以致难以进行相关。重组酶也用于估计每种细胞色素P450对活性成分代谢的相对贡献。由于细胞色素P450在重组系统中的表达水平不同，与天然人肝微粒体相比通常提高很多，有必要引入校正因子，以外推与人微粒体相比重组微粒体中每种CYP450的贡献(校正因子＝相对活性因子)。此校正因子必须通过实验测量所测试的每种CYP450的酶活性来计算，首先，在天然人微粒体的存在下测量，其次，在重组微粒体的存在下测量。此方法使得可能以选择性和半定量的方式直接评价每种酶对活性成分代谢的相对贡献。但是，由于其固有特征，这些重组酶与见于肝微粒体中的酶不同(截短的蛋白质序列、不同的膜环境、细胞色素b5和P450之间的不同偶联、多种CYP450之间的竞争的缺乏)。在活性成分与人肝微粒体共孵育后，用针对酶的生物抑制剂(如单克隆抗体)(对比“无抗体的对照”)来定量估计活性成分的代谢。但是，所使用的相当数量的抗体显示缺乏特异性和抑制力。最后，此技术不方便用于代谢途径的表型分析。如果抑制完全且对所研究的酶特异，则CYP450化学抑制剂使得可能借助活性成分代谢的百分比抑制直接测定每种细胞色素P450的贡献。抑制剂可以可逆地或非可逆地结合酶。它们用于与活性成分和人肝微粒体共孵育或预孵育(与无抑制剂的对照条件相比)——活性成分氧化代谢途径的体内环境的代表性模型。与竞争型可逆抑制剂(最常见的类型)相关的抑制水平依赖于孵育条件，如孵育时间和底物浓度。此外，常用于表型分析研究的许多CYP450抑制剂并非对单种CYP450特异(例如，酮康唑、栎精……)。因此，可逆抑制剂不适合用于细胞色素P450表型分析。为了纠正这些方法的缺点，使用非可逆或不可逆抑制剂，以获得代表体内条件的稳健定量方法。在酶永不恢复其活性时称抑制是不可逆的；参考“自杀”抑制。细胞色素P450氧化非可逆抑制剂，形成不可逆地结合
酶的中间代谢物。此过程称为MBI(代表基于机制的抑制)，因为起始化合物无抑制性，而是需要至少一个酶的催化循环，然后活化为共价结合该酶的反应性代谢物。MBI抑制表征为所研究的细胞色素P450的不可逆抑制，且不依赖于底物浓度。这些抑制剂遵循具有以下常数的一级动力学：kinact对应于最大酶失活速率，KI对应于最大失活速率一半时的抑制剂浓度。为了用不可逆抑制剂获得CYP450的完全抑制，必须组合若干条件：1)有必要使用足够浓度的非可逆抑制剂(取决于其KI)；2)取决于其kinact，抑制剂与肝微粒体预孵育的时期必须足以产生足够的催化失活循环；3)预孵育的时期不得产生自杀抑制剂的耗竭，使得其浓度变得太低而不能完全抑制P450。如果CYP450的抑制完全且特异(没有其他P450受抑制)，因此可能定量测定每种细胞色素P450在活性成分代谢中的参与。则所使用的实验安排如下：尽管有上述优势，但此实验安排的MBI的使用具有限制其益处的一定数量的限制：-一方面，所研究的活性成分的孵育条件依赖于非可逆抑制剂预孵育的最适条件(微粒体蛋白质浓度、有机溶剂百分比)。实际上，为了精确测量活性成分代谢的百分比抑制，必须在所谓初始条件下孵育活性成分(代谢速率作为时间和蛋白质浓度的函数的线性；百分比溶剂不得超过某个水平)。为了在此线性实验安排中获得最大和特异的抑制，之前必须在与活性成分孵育相容的蛋白质浓度或溶剂浓度的体外条件下孵育抑制剂本身。-另一方面，预孵育时间改变微粒体CYP450的酶活性，微粒体CYP450
具有约70至90分钟的体外半衰期。例如，所观察到的CYP2D6酶活性的丧失，在预孵育时间为30分钟的情况下为至多26％，在预孵育时间为40分钟的情况下为至多35％，在预孵育时间为60分钟的情况下为46％。因此，实验安排所施加的MBI预孵育和候选药物孵育的连续序列的持续时间由此与微粒体CYP450的体外半衰期不相容。-最后，用于一种CYP450的不可逆抑制剂通常也对一种或多种CYP450显示可逆抑制(例如，CYP1A2的MBI抑制剂也是CYP2C19的竞争性抑制剂，CYP2B6的MBI抑制剂也是CYP2A6和3A4的竞争性抑制剂)。因此，对于体外表型分析研究，以上线性实验安排不能令人满意地消除能够竞争性作用于其他CYP450的剩余游离抑制剂部分。稀释预孵育物可以降低游离抑制剂的浓度，产生更少的非特异性可逆抑制，但实际上这将以这样的方式降低微粒体蛋白质的浓度，使得孵育期间活性成分的代谢将太弱而检测不到。因此，制备一方面可用于不可逆抑制剂，另一方面与用于活性成分的孵育条件相容的孵育条件的这种困难，使得很少有可能使用该线性实验安排。此外，在线性实验安排的情况下，有必要加入两个系列的附加孵育(含和不含不可逆抑制剂)，用所测试的CYP450的特异性底物作为阳性对照，验证抑制剂的作用。这因此不仅需要定量活性成分，还需定量全部特异性底物，待测试的许多CYP450的情况都是这样，这使得实验显著更麻烦。鉴于参与活性成分代谢的酶促反应的表型分析方法的各种缺点，该酶促反应表型分析的体外研究需要克服之前所述多种方法的不足。因此，本专利技术的目的是提出备选策略，该策略使得可能通过使用分离的受不可逆抑制的微粒体，来克服实施参与活性成分代谢的酶促反应的表型分析研究中所固有的问题。本专利技术涉及制备具有受不可逆抑制的细胞色素P450(CYP450)的分离的微粒体的方法，其包括以下步骤：-不可逆抑制细胞色素P450；-浓缩微粒体蛋白质。非可逆抑制剂、不可逆抑制剂、MBI抑制剂、不可逆抑制或自杀抑制理解为指能够共价结合酶的抑制剂；受这样抑制的酶不能恢复其初始功能活性。更具体而言，MBI(基于机制的抑制)抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备包含受不可逆抑制的细胞色素P450(CYP450)的分离的微粒体的方法，其特征在于它包括以下步骤：a)不可逆抑制细胞色素P450；b)浓缩微粒体蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.05 EP 13306674.6;2013.12.05 US 61/912,1861.制备包含受不可逆抑制的细胞色素P450(CYP450)的分离的微粒体的方法，其特征在于它包括以下步骤：a)不可逆抑制细胞色素P450；b)浓缩微粒体蛋白质。2.权利要求1的方法，其特征在于它包括一个或多个洗涤步骤。3.权利要求2的方法，其特征在于一个或多个洗涤步骤置于浓缩微粒体蛋白质的步骤之前和/或之后。4.权利要求1的方法，其特征在于通过过滤/离心或超速离心来获得微粒体的浓缩。5.权利要求1的方法，其特征在于将微粒体浓缩至10mg/ml至30mg/ml的浓度。6.权利要求1的方法，其特征在于它包含最后的保存步骤。7.权利要求6的方法，其特征在于保存步骤是冷冻。8.权利要求1的方法，其特征在于微粒体是人肝微粒体。9.权利要求1的方法，其特征在于受不可逆抑制的细胞色素P450选自CYP1家族、CYP2家族和CYP3家族。10.权利要求9的方法，其特征在于细胞色素P450选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·卡拉德克，Y·帕尔芒捷，C·波蒂埃，
申请(专利权)人：法国施维雅药厂，
类型：发明
国别省市：法国;FR