以阳离子脂质体DOTAP为佐剂的疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种以阳离子脂质体DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵)作为佐剂的疫苗及其制备方法。该疫苗由蛋白质抗原与阳离子脂质体DOTAP制备而成，抗原分子与DOTAP脂质形成0－500nm±的胶束结构，抗原分子包裹在胶束的亲水内核中或镶嵌在胶束膜中。DOTAP作为疫苗佐剂通过与抗原分子形成胶束结构，可明显提高抗原提呈细胞对抗原的摄取和提呈；同时与传统佐剂通过Toll样受体途径激活抗原提呈细胞不同，DOTAP可通过促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP)途径激活抗原提呈细胞，从而诱导特异性的免疫应答，该途径炎症因子释放少，炎症反应低，因此安全性更好；DOTAP作为疫苗佐剂既可诱导体液免疫应答和又可诱导细胞免疫应答，克服了传统铝佐剂只能诱导体液免疫应答的缺陷。

【技术实现步骤摘要】

本文涉及一种以阳离子脂质体DOTAP作为佐剂的疫苗及其制备方法，属于生物

技术介绍
佐剂是指加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂增强免疫应答的机制尚未完全阐明，不同佐剂也不尽相同，但概括而言，可归纳为：一，佐剂和抗原一起进入机体后，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，有利于抗原的缓释，延长抗原在体内存留的时间；二，被佐剂吸附的抗原更易被吞噬细胞吞噬，促进对抗原的处理，易在局部形成炎症反应；三，刺激淋巴细胞增殖和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应；四，增强巨噬细胞和淋巴细胞膜的通透性，促进其对抗原的有效处理和提呈。自从1926年Glenny首次用明矾沉淀白喉类毒素制成抗原免疫豚鼠，取得了较强的免疫效果，铝佐剂已广泛应用于百白破、乙肝等多种疫苗中，并取得了良好的效果，其安全性和有效性得到了公认，成为人用疫苗中使用最广泛的一种佐剂。然而，随着铝佐剂的广泛应用，其不足之处也逐渐暴露。首先铝佐剂不能冻干；制备的凝胶批与批之间差异大，质量难控制且对佐剂的效果很难做出准确的评价；更为重要的是，铝佐剂只能诱导产生体液免疫应答，不能诱导产生细胞免疫应答；还可诱导产生IgE抗体，增加了发生超敏反应的危险。而一个理想的疫苗佐剂应具有以下特点：可增强抗原的免疫原性，特别是一些无免疫原性或弱免疫原性的抗原物质；可增强机体的免疫反应性，特别是那些免疫机能低下人群；能诱导产生高亲和力的抗体的同时，可诱导产生细胞免疫应答；可引起或增强迟发型超敏反应；对机体固有免疫的激活适度，诱导产生较低水平的引起不良反应的炎症因子IL-1、TNF-α等，免疫副反应小。2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)是一种常用的阳离子脂质体，由于它与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内，因此一直作为一种真核细胞转染试剂用于真核细胞的转染和DNA疫苗的载体。近年来的研究发现，DOTAP还是一种很好的免疫调节剂，将多肽或蛋白质抗原与DOTAP包装制备成阳离子脂质体可明显提高抗原提呈细胞对抗原的提呈能力，同时与传统佐剂通过Toll样受体途径激活抗原提呈细胞不同，DOTAP可通过促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP)途径激活抗原提呈细胞，从而诱导特异性的免疫应 答。该途径炎症因子释放少，炎症反应低。因此如果将DOTAP作为一种新的疫苗佐剂既可以增强免疫应答的强度，又避免了传统铝佐剂免疫副反应强的缺点。目前国内外尚无使用DOTAP作为蛋白质疫苗佐剂的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种以阳离子脂质体DOTAP作为佐剂的疫苗，该疫苗通过将蛋白质抗原与阳离子脂质体DOTAP包装、挤压形成0－500nm的蛋白质阳离子脂质体纳米颗粒，疫苗的免疫原性明显提高，同时可降低疫苗免疫后的不良反应。本专利技术提供了一种以阳离子脂质体DOTAP作为佐剂的疫苗的制备方法。本专利技术提供的H5N1型流感阳离子脂质体DOTAP佐剂疫苗的制备方法，通过以下技术方案完成：疫苗组成成分：H5N1型流感裂解疫苗原液(H5N1型血凝素抗原0－100μg/ml，总蛋白与血凝素含量比为1：2－1：4)；阳离子脂质DOTAP(0－3000μg/ml)；含30mM氯化钠的等渗葡萄糖溶液。所述的H5N1型流感裂解疫苗原液是采用WHO发布的购置于英国NIBSC的毒株按照中国药典2010版3部中流感疫苗生产工艺的方法制备而成，并用等渗葡萄糖溶液稀释而成。所述的的阳离子脂质体DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵)购置于加拿大TRC公司，纯度>98％。H5N1型流感阳离子脂质体DOTAP佐剂疫苗的制备方法：将DOTAP溶解于1：1的甲醇和氯仿溶剂中，真空旋转蒸发2小时后形成脂膜，加入一定浓度的H5N1型流感病毒裂解疫苗原液，30℃充分混合2小时后，通过800nm、400nm、200nm孔径的碳酸纤维酯膜分别4次挤压。马尔文粒度分析仪检测脂质体粒径，平均粒径应在200nm±，粒径分散指数PDI值应≤0.25,和zata电位为正电荷。DOTAP阳离子脂质体包封率检测：以40000g的离心力超速离心，将脂质体微粒完全沉淀，用微量BCA法检测上清中的游离抗原的蛋白浓度，从而计算脂质体包封率的检测方法。计算公式为：包封率＝[1－(上清中抗原浓度×溶液体积)/(抗原给药浓度×给药体积)]×100％。包封率应≥50％。附图说明图1：0.1μg剂量不同实验组血凝抑制抗体动态变化曲线。图2：1μg剂量不同实验组血凝抑制抗体动态变化曲线。图3：10μg剂量不同实验组血凝抑制抗体动态变化曲线。图4：不同剂量实验组免疫后42天血清抗体保护率。图5：不同剂量实验组免疫后42天血清总IgG抗体水平比较。图6：不同剂量实验组免疫后42天血清亚型抗体IgG1水平比较。图7：不同剂量实验组免疫后42天血清亚型抗体IgG2a水平比较。图8：不同剂量DOTAP组免疫后血清总IgG抗体水平比较。图9：不同剂量DOTAP组免疫后42天血凝抑制抗体水平比较。图10：不同实验组脾脏淋巴细胞体外培养IL-2分泌水平比较。图11：不同实验组脾脏淋巴细胞体外培养IFN-γ分泌水平比较。图12：不同实验组脾脏淋巴细胞体外培养IL-4分泌水平比较。图13：HBsAg阳离子脂质体佐剂疫苗SDS-PAGE电泳结果,1：HBsAg原液；2：HBsAg脂质体溶液；3：HBsAg脂质体离心后沉淀；4：HBsAg脂质体离心后上清；5：空白脂质体；6:蛋白质标准。图14：透射电子显微镜观察HBSAg阳离子脂质体(20μg/ml HBs)。图15：不同实验组HBs IgG抗体几何平均滴度比较(A:免疫后14天；B:免疫后28天；C:免疫后42天)图16：初免后42天不同实验组亚型抗体几何平均滴度比较(A:IgG1；B:IgG2a)具体实施方式以下通过实例对本专利技术进行进一步说明，本专利技术包括但不仅限于以下实例。实施例1含H5N1型血凝素抗原10μg/ml，DOTAP3000μg/ml的阳离子脂质体佐剂疫苗的制备。将H5N1型流感裂解疫苗原液用含30mM氯化钠的等渗葡萄糖溶液稀释至血凝素抗原10μg/ml。准确称取DOTAP30mg至茄型瓶中，加入甲醇、氯仿各2ml，充分溶解后，在30℃，30rpm条件下真空旋转蒸发2小时，至有机溶剂完全挥发，DOTAP在瓶底形成均匀的脂膜。加入10ml含H5N1型血凝素抗原10μg/ml的稀释后的H5N1型流感裂解疫苗原液，30℃，60rpm旋转茄型瓶2小时，使脂膜与抗原溶液充分融合。将复水后的脂质体抗原溶液分别通过800nm、400nm、200nm孔径的碳酸纤维酯膜各挤压4次得到微乳光澄清透明溶液。马尔文粒度分析仪检测脂质体粒径，平均粒径应在200nm±，粒径分散指数PDI值应≤0.25，和zata电位为正电荷。实施例2含H5N1型血凝素抗原50μg/ml，DOTAP3000μg/ml的阳离子脂质体佐剂疫苗的制备。将H5N1型流感裂解疫苗原液用含30mM氯化钠的5％葡萄糖溶液稀释至血凝素抗原50μg/ml。准确称取DOTAP30mg至茄型瓶中，加入甲醇、氯仿各2ml,充分溶解后，在30℃，30rpm条件下真空旋转蒸发2小时，至有机溶剂完全挥发，D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含由2,3‑二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)制成的作为佐剂的阳离子脂质体和单价或多价的蛋白质抗原，优选地，所述阳离子脂质体由作为阳离子脂质的2,3‑二油氧基丙基三甲基氯化铵组成。

【技术特征摘要】
1.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含由2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)制成的作为佐剂的阳离子脂质体和单价或多价的蛋白质抗原，优选地，所述阳离子脂质体由作为阳离子脂质的2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵组成。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述单价或多价的蛋白质抗原为裂解疫苗原液，优选为流感裂解疫苗原液或重组乙肝表面抗原，更优选为H5N1流感裂解疫苗原液、H5N2流感裂解疫苗原液、H7N2流感裂解疫苗原液、H7N3流感裂解疫苗原液、H7N7流感裂解疫苗原液、H9N2流感裂解疫苗原液、H10N7流感裂解疫苗原液和H7N9流感裂解疫苗原液。3.根据权利要求1-2任一项所述的疫苗，其特征在于，所述2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵为2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵的旋光异构体，优选R-2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵。4.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗，其特征在于，所述阳离子脂质体和蛋白质抗原的比例为1000:...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻刚，赵巍，郝鹏亮，韩锡鑫，韩静，刘洋，张家友，杨晓明，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42