本发明专利技术涉及一种用于食品中肠致病性大肠杆菌检测的试剂盒。肠致病性大肠杆菌EPEC作用部位在小肠，粘附在十二指肠、空肠和回肠上段粘膜、使微绒毛刷状缘破坏。是婴幼儿腹泻的主要病原菌。现有技术的检测方法耗时耗力，检测不便，而本发明专利技术提供了特异性检测肠致病性大肠杆菌的试剂盒，试剂盒中含有特异性结合肠致病性大肠杆菌的适配子，所述适配子为单链DNA。本发明专利技术试剂盒具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种用于食品中肠致病性大肠杆菌检测的试剂盒。
技术介绍
致病性大肠杆菌(EPEC)是一种以粪口途径传播的，能导致人类多系统感染的肠道致病菌，尤其是引起婴幼儿的腹泻，成人的肠道及泌尿系统感染。自七十年代以来，EPEC已成为医院获得性感染中一种活跃的病原微生物。致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌，不产生毒素，有高度传染性，严重者可致死，成人少见。致病性大肠杆菌根据是否含有EPEC黏附因子(EPEC adherence factor,EAF)的质粒而被分成典型致病性大肠杆菌(typical EPEC)和非典型致病性大肠杆菌(atypical EPEC)。非典型致病性大肠杆菌既可以感染人也可以感染牲畜；典型致病性大肠杆菌以人为唯一宿主，而且多见于发展中国家，发达国家较少见。肠致病性大肠埃希菌是引起全球婴幼儿腹泻和成人散发性腹泻的重要病原菌之一，目前研究表明EPEC主要通过黏附和脱落损伤导致肠粘膜损伤。肠致病性大肠埃希菌EPEC感染的特点是病原菌能本能性粘附到宿主细胞膜，破坏细胞微绒毛，并在粘附细菌下诱导由细胞支架蛋白形成杯样基底膜，运种现象称之为\粘附与脱落损伤\。EPEC的粘附与脱落效应特征是依赖Es地、EspD和EspA转运蛋白构成了对宿主细胞的紧密粘附，并在粘附细胞下清除细胞微绒毛，积累纤维肌动蛋白。Es地蛋白可与EspD蛋白相互作用而插入宿主细胞膜形成微孔，使得EPEC毒力因子可通过细胞膜上形成的微孔直接进入宿主细胞，入侵的毒力因子促使细菌粘附与抹平效应的形成。Es地缺失的突变EPEC不能介导临近粘附细胞微绒毛的延伸，也不能阻止巨隧细胞的吞隧作用。由于Es地蛋白是肠致病性大肠杆菌致病的关键蛋白，若能找到能抑制EPEC的致病作用的物质，将为EPEC治疗寻找新的策略，为未来预防和治疗EPEC做出重大贡献。目前，国内外在食品中大肠杆菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象各有不同而各具优缺点。传统检测大肠杆菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好，但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(PCR)技术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚合酶链式反应(PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应(PCR)技术，如多重PCR技术，然而多重PCR虽简化了PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测结果。通过指数富集配体的系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选获得的寡核苷酸序列称为适配子(aptamer)。其原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得靶分子的特异寡核苷酸配基。该技术具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点。在临床检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配子，以检测靶物质，已成为该领域的研究热点。利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，适配子的靶分子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过复合靶子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸配基。适配子比抗体具有更高的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得适配子在生物医药和食品卫生研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。
技术实现思路
本专利技术公开了一种高特异高敏感检测肠致病性大肠杆菌EPEC的方法，提高了它的检测和诊断效率。为了解决现有大肠氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本专利技术提供一种特异识别肠致病性大肠杆菌的试剂盒及其应用。上述试剂盒，适配子可以采用生物素标记。本专利技术中，所述的核酸适配体能够特异结合肠致病性大肠杆菌。本专利技术另外提供一种肠致病性大肠杆菌适配子的筛选方法。随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成。随机单链DNA文库：5’-TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3’(注：n35代表35个A、T、C、G碱基中任意一种的35个集合)。引物Ⅰ：5’–TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3’引物Ⅱ：5’-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3’引物Ⅲ:5’-地高辛–TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3’引物Ⅳ：5’-生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3’。2.SELEX筛选获得肠致病性大肠杆菌特异的寡核苷酸适配子1)SELEX筛选过程：a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA 10μg加入到400ul 1×结合缓冲液，95度变性5min，然后迅速置于冰上10min；b.加入1mL肠致病性大肠杆菌菌悬液2.0×108,于37℃摇床100rpm结合1.2小时，使单链DNA文库与菌充分作用；c.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA，室温下离心10 000rpm离心10min分离未与菌结合的单链DNA文库；d.弃上清，加入600μL 1×冲洗缓冲液，离心10 000rpm离心10min，重复此过程4次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；e.接上步离心后去上清，加入100μL去离子水99℃加热3min，高速离心18 000rpm离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中),-20℃保存备用。2)PCR富集与肠致病性大肠杆菌特异结合的寡核苷酸适配子：每轮筛选后获得的与肠致病性大肠杆菌特异结合的寡核苷酸适配子文库通过PCR扩增得到富集；a.以上述上清为模板，通过引物Ⅰ和引物Ⅳ扩增产生一端带生物素标记的双链DNA；b.PCR扩增条件：95℃预变性3min，然后进行30循环95℃变性35s，60℃退火37s，72℃延伸33s，最后72℃延伸10min；c.PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作用与链亲合素交联的磁珠结合，经过1×连接(the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涤3次，用100mM的新鲜NaOH 37℃变性30min,使不带生物素的单链DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于食品中肠致病性大肠杆菌检测的试剂盒，其含有能特异性结合的核酸适体。
【技术特征摘要】
1.一种用于食品中肠致病性大肠杆菌检测的试剂盒，其含有能特异性结合的核酸适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨国林，
申请(专利权)人：杨国林，
类型：发明
国别省市：北京;11
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