一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法技术

本发明专利技术公开了一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法，该模型构建方法包括：构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型；用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型；采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，本发明专利技术同时公开一种检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制；检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，检测treg细胞表面GITR的表达。本发明专利技术针对乌司他丁在乳腺癌中的治疗价值的研究在国内外均属首例，针对该药物影响肿瘤微环境机制的研究将为该药物应用于乳腺癌治疗特别是三阴性乳腺癌治疗的临床使用提供应用基础研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于乳腺癌治疗领域，尤其涉及一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法。
技术介绍
专利技术人通过前期研究工作发现：1)乌司他丁抑制乳腺癌细胞增殖、促使细胞凋亡，其机制可能与乌司他丁降低免疫/炎症因子TNF-a、IL-6和IL-10的表达和调节免疫微环境有关。2)乌司他丁和泰索帝均可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭、转移，乌司他丁可增强泰索帝的抑制作用，机制可能与下调TGF-β的表达，抑制血管形成，上皮间皮转化有关，同时，也与乌司他丁下调乳腺癌细胞CXCR4的表达水平相关。3)乌司他丁联合泰索帝抑制乳腺癌增殖及转移，可能与调节乳腺癌微环境中CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T相关。研究表明，乌司他丁具有抑制乳腺癌包括三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)增殖转移的作用，其中对肿瘤免疫微环境中Treg的影响可能起着关键作用。Treg促进肿瘤发生免疫逃逸是通过肿瘤细胞产生的大量趋化因子CCL22招募高表达趋化因子受体CCR4的Treg到肿瘤周围，一方面使肿瘤组织处于免疫抑制环境中，从而促进肿瘤细胞的增殖；另一方面，Treg大量聚集在肿瘤组织周围，形成富含Treg的细胞层，可有效阻碍自然杀伤性细胞(natural killer cell，NK)和Tc等淋巴细胞对肿瘤细胞的攻击。而肿瘤分泌趋化因子CCL22过程中存在着TGF-β-microRNA-34a-CCL22轴，活化的TGF-β可抑制microRNA-34a基因的表达，从而使趋化因子CCL22产生增加，说明转化生长因子TGF-β与趋化因子CCL22呈正相关，因此可以假设乌司他丁通过TGF-βmicroRNA-34a-CCL22轴影响肿瘤
细胞产生的CCL22数量。而前期的研究以及文献均提示乌司他丁可降低肿瘤细胞及淋巴细胞分泌的TGF-β。因此前期工作中发现乌司他丁降低肿瘤组织周围及瘤内的Treg，可能是通过作用于TGF-βmicroRNA-34a-CCL22轴，降低肿瘤细胞分泌CCL22的数量，从而减少肿瘤组织周围Treg的聚集，减少肿瘤发生免疫逃逸，抑制肿瘤增殖、侵袭及远处转移。另有研究显示，Treg表面抑制性免疫受体糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-inducedtumor necrosis factorreceptor，GITR)，可与DC表面的GITR配体结合，促进Treg的增殖，并抑制DC表面GITR配体的数量，使其与其他效应性T细胞的结合力下降，抑制效应性T细胞的功能。由此可见，肿瘤细胞分泌的CCL22和Treg表面的GITR，是调节乳腺癌免疫微环境的潜在靶点。目前，关于乌司他丁可能是通过抑制肿瘤细胞分泌CCL22，并降低Treg表面GITR的表达，抑制三阴性乳腺癌微环境中调节性T细胞的数量与功能，控制肿瘤生长及转移的资料尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法，旨在研究关于乌司他丁可能是通过抑制肿瘤细胞分泌CCL22，并降低Treg表面GITR的表达，抑制三阴性乳腺癌微环境中调节性T细胞的数量与功能，控制肿瘤生长及转移，为三阴性乳腺癌的有效治疗提供新方向的问题。本专利技术是这样实现的，一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法，所述的乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法包括：构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型；用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型；采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型。本专利技术另一目的在于提供一种检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，所述检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法包括以下
步骤：步骤一、通过构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，采用定量PCR与Western blot检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制；步骤二、通过用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，采用流式细胞术与Western blot方法检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫微环境的影响；步骤三、通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，应用Western blot方法检测treg细胞表面GITR的表达，验证乌司他丁通过Treg细胞功能的改变对肿瘤细胞生物学行为的影响。进一步，所述检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制，采用的方法为：通过TNBC细胞模型检测验证乌司他丁对TNBC细胞中分泌的趋化因子CCL22的量的改变；应用乌司他丁处理TNBC细胞，提取细胞RNA，确认RNA质量；通过实时荧光定量PCR检测CCL22在mRNA水平的表达改变；应用乌司他丁处理TNBC细胞，提取细胞总蛋白，确认蛋白质量；通过Western blot检测相应细胞中的蛋白表达情况，通过比较明确乌司他丁对CCL22在蛋白水平的表达影响；应用乌司他丁处理TNBC细胞，收集培养基中蛋白质，确认蛋白质质量；通过ELISA检测培养基中CCL22的水平，验证乌司他丁对TNBC细胞中分泌的CCL22的量的改变。进一步，所述检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫微环境的影响的方法为：构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，取肿瘤组织，流式细胞术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋巴结中Treg的量，验证
检测CCL22对Treg的招募作用；检测肿瘤体积大小，肿瘤组织中Treg表达的免疫因子IL-10、TGF-β的表达差异，以及肿瘤远处转移情况，通过分析检测Treg的数量对肿瘤生长及转移的影响。进一步，所述检测treg细胞表面GITR的表达，验证乌司他丁通过Treg细胞功能的改变对肿瘤细胞生物学行为的影响的方法为：通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，用乌司他丁处理，比较肿瘤生长转移情况，研究乌司他丁对移植瘤的影响；取肿瘤组织，流式细胞术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋巴结中Treg的量，同时用western blot法检测Treg细胞中GITR的表达；通过分析检测乌司他丁对GITR的表达调节作用以及对Treg细胞招募的影响和肿瘤生物学行为的影响。进一步，所述的分析采用SPSS.19.0统计学软件处理数据，数据以表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用LSD-t或Tamhane法，检验水准α＝0.05。本专利技术针对乌司他丁在乳腺癌中的治疗价值的研究在国内外均属首例，针对该药物影响肿瘤微环境机制的研究(如，最新有价值的发现：乌司他丁联合化疗药物可降低乳腺癌肿瘤微环境中CD4+CD25+FoxP3+/CD4+T细胞的比值)将为该药物应用于乳腺癌治疗特别是三阴性乳腺癌治疗的临床使用提供应用基础研究。附图说明图1是本专利技术提供的检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法流程图。具体实施方式为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。通过本专利技术：1)、乌司他丁与环磷酰胺或泰索帝配伍，抑制乳腺癌细胞MCF-7/DA-MB-231增殖，其机制可能与乌司他丁降低免本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法，其特征在于，所述的乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法包括：构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型；用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型；采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型。

【技术特征摘要】
1.一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法，其特征在于，所述的乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法包括：构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型；用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型；采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型。2.一种利用权利要求1所述方法检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，其特征在于，所述检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法包括以下步骤：步骤一、通过构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，采用定量PCR与Western blot检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制；步骤二、通过用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，采用流式细胞术与Western blot方法检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫微环境的影响；步骤三、通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，应用Western blot方法检测treg细胞表面GITR的表达，验证乌司他丁通过Treg细胞功能的改变对肿瘤细胞生物学行为的影响。3.如权利要求2所述的检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，其特征在于，所述检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制，采用的方法为：通过构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，应用乌司他丁处理TNBC细胞，提取细胞RNA，确认RNA质量；通过实时荧光定量PCR检测CCL22在mRNA水平的表达改变；应用乌司他丁处理TNBC细胞，提取细胞总蛋白，确认蛋白质量；通过Western blot检测相应细胞中的蛋白表达情况，通过比较明确乌司他丁对CCL22在蛋白水平的表达影响；应用乌司他丁处理TNBC细胞，收...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙治君，陈建生，高峰，赵晓亮，罗杰，钟彪，王宏，王宁，孙昕，
申请(专利权)人：孙治君，
类型：发明
国别省市：重庆;50