一种用于肺癌筛查的组合物及其应用制造技术

技术编号:13672673 阅读:67 留言:0更新日期:2016-09-07 21:05
本发明专利技术提供了一种用于肺癌筛查的组合物,所述组合物包含分别用于检测SHOX2基因、PTGE4基因和FOXL2基因中的每个基因的至少一个靶区域内甲基化程度的核酸序列;其中,所述靶区域为分别选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的连续的至少18个碱基长度的片段;所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域。本发明专利技术还提供了上述组合物在制备筛查肺癌的试剂中的应用,以及用于筛查肺癌的试剂盒。利用本发明专利技术的组合物可以通过综合SHOX2、PTGER4和FOXL2的甲基化检测结果来表明细胞增殖性异常的存在。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因检测领域,尤其涉及基因标识物的筛选、基因标识物的组合应用和将该基因标识物组合在疾病的体外辅助诊断中的应用。
技术介绍
癌症是一种因细胞增殖性异常而导致的疾病,同时也是一个主要的公共健康难题,根据国家癌症中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》显示,全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病第一位的是肺癌,其次为结直肠癌、肝癌和食管癌;死亡第一位的是肺癌,其次为肝癌、食管癌和结直肠癌。我国肺癌的发病率及死亡率已跃居各种肿瘤的首位,成为严重威胁人民健康的疾病之一。肺癌发病隐匿,多数早期肺癌患者的癌灶未能及时被发现,大多肺癌病人被发现和确诊时疾病已进展为中晚期,失去手术或治疗的最佳机会,这也是肺癌死亡率高居不下的原因之一。尽管过去几十年中,肺癌的诊断、分期、外科手术治疗、研究方面取得了重大的进步,但是相比乳腺癌、结直肠癌以及前列腺癌,肺癌的五年生存率较低,始终保持在16%左右。肺癌患者往往处于晚期时才被发现和确诊,丧失了最佳的治疗时机。如果能早发现、早治疗,势必能有效的改善患者的预后,提高5年存活率、降低死亡率。但是与前列腺癌和乳腺癌相比,肺癌目前仍然缺乏理想的早期辅助诊断手段。目前临床所使用的肺癌筛查诊断方法主要靠低剂量螺旋CT和胸部X射线影像资料检查,除此之外,还有其它多种辅助手段帮助支持肺癌的诊断,如纤维支气管镜、痰细胞学检查、肿瘤标志物检测等,但经长期研究发现,上述这些方法各有利弊,都分别存在费用高、投入大、并存在敏感度低、漏诊率高、假阳率高、不能早期诊断的局限性,有的还给患者造成痛苦和不便。因此,迫切需要敏感、特异的生物标记。而随着生物科技的不断发展,利用基因检测来诊断疾病的方法受到了广泛的瞩目。其中DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,不仅在维持正常细胞功能,而且在癌症发生中也起着重要的作用,即甲基化状态的改变是引起癌症的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化程度降低和CpG岛局部甲基化程度的异常升高,从而导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活,则发生癌症的机率提高。因此,甲基化的研究,为癌症的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据,是目前的研究热点之一。
技术实现思路
基于上述
技术介绍
,本专利技术的目的在于提供一种通过综合分析基因甲基化谱(methylome)数据,筛选适用于液相活检的癌症甲基化基因标识物,进而得到针对所述癌症甲基化基因标识物的用于肺癌筛查的组合物。本专利技术提供了一种用于肺癌筛查的组合物,所述组合物包含分别用于检测SHOX2基因、PTGER4基因和FOXL2基因中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列;其中,所述靶区域为分别选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的连续的至少18个碱基长度的片段;所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域;优选地,所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。在根据本专利技术的一个实施方案中,所述核酸序列为引物和探针,其中,所述引物和探针具有以下特征:1)可扩增人造的甲基化的所述靶区域,而不能扩增人造的非甲基化的所述靶区域;2)在以正常的人白细胞中提取的DNA为模板时显示没有扩增,但在以人肺癌组织中提取的DNA为模板时显著扩增;优选地,所述引物和探针还包括以下特征:3)在以从正常人的血浆提取的DNA为模板时显示没有扩增,但在从肺癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增。在根据本专利技术的一个实施方案中,检测SHOX2基因的引物和探针为组合1或组合2;组合1引物:SEQ ID No 1,探针:SEQ ID No 2,引物:SEQ ID No 3;组合2引物:SEQ ID No 4,探针:SEQ ID No 5,引物:SEQ ID No 6。在根据本专利技术的一个实施方案中,检测PTGER4基因的引物和探针选自组合3、组合4和组合5中的一种;组合3引物:SEQ ID No 7,探针:SEQ ID No 8,引物:SEQ ID No 9;组合4引物:SEQ ID No 10,探针:SEQ ID No 11,引物:SEQ ID No 12;组合5引物:SEQ ID No 13,探针:SEQ ID No 14,引物:SEQ ID No 15。在根据本专利技术的一个实施方案中,检测FOXL2基因的引物和探针为组合6或组合7;组合6引物:SEQ ID No 16,探针:SEQ ID No 17,引物:SEQ ID No 18;组合7引物:SEQ ID No 19,;探针:SEQ ID No 20,引物:SEQ ID No 21。本专利技术还提供了上述组合物在制备用于检测肺癌的试剂中的应用。本专利技术进一步提供了一种用于筛查肺癌的试剂盒,所述试剂盒包含上述组合物。本专利技术进一步提供了一种用于上述试剂盒的样本处理方法,所述方法包括:a)提供人源样本,所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种;优选地选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种;b)由步骤a)的样本中提取基因组DNA,并进行预处理使所述基因组DNA的5’位未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一碱基;c)以步骤b)处理后的基因组DNA为模板,利用上述的组合物进行PCR扩增;优选地,在PCR扩增中以β肌动蛋白(ACTB)为内对照基因;更优选地,所述β肌动蛋白(ACTB)的引物和探针为:引物:SEQ ID NO:22,探针:SEQ ID NO:23,引物:SEQ ID NO:24。在根据本专利技术的一个实施方案中,步骤b)所述的预处理是通过亚硫酸氢盐试剂实现的;优选地,所述亚硫酸氢盐试剂与变性剂联用,所述变性剂为正烷基二醇,优选为二乙二醇二甲基醚(DME)、二噁烷或二噁烷衍生物;更优选地,所述亚硫酸氢盐试剂与清除剂联用,所述清除剂为色原烷衍生物,优选地选自6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷2-羧酸,三羟基苯甲酸或其衍生物中的一种。在根据本专利技术的一个实施方案中,步骤c)所述的PCR扩增为实时PCR扩增;优选地,PCR反应混合物包括经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400μM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2×PCR缓冲至最终的2μl至100ul的体积;所述PCR的反应条件为:在85至99℃持续3-60分钟,然后在50~72℃进行1~30秒的35-55个循环,在45~80℃下退火5~90秒,在85~99℃下变性5~90秒。另一方面,本专利技术具有以下有益效果:本专利技术将SHOX2、PTGER4和FOXL2三个靶基因结合在一起进行肺癌筛查,通过将分别用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段的甲基化的核酸序列联合使用,使得肺癌检测的灵敏度和特异性,尤其是肺癌检测的灵敏度得到了显著提高,从而保证了检测结果的正确性和可靠性。具体而言,根据某些具体实施方式,SHOX2的灵敏度为75%,PTGER4的灵敏度为60%,FOXL2的灵敏度为50%,三个标志物多元检测时本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种用于肺癌筛查的组合物,其特征在于,所述组合物包含分别用于检测SHOX2基因、PTGE4基因和FOXL2基因中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列;其中,所述靶区域为分别选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的连续的至少18个碱基长度的片段;所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域;优选地,所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。

【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌筛查的组合物,其特征在于,所述组合物包含分别用于检测SHOX2基因、PTGE4基因和FOXL2基因中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列;其中,所述靶区域为分别选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的连续的至少18个碱基长度的片段;所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域;优选地,所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述核酸序列为引物和探针,其中,所述引物和探针具有以下特征:1)可扩增人造的甲基化的所述靶区域,而不能扩增人造的非甲基化的所述靶区域;2)在以正常的人白细胞中提取的DNA为模板时显示没有扩增,但在以人肺癌组织中提取的DNA为模板时显著扩增;优选地,所述引物和探针还包括以下特征:3)在以从正常人的血浆提取的DNA为模板时显示没有扩增,但在从肺癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增。3.如权利要求2所述的组合物,其特征在于,检测SHOX2基因的引物和探针为组合1或组合2;组合1引物:SEQ ID No 1,探针:SEQ ID No 2,引物:SEQ ID No 3;组合2引物:SEQ ID No 4,探针:SEQ ID No 5,引物:SEQ ID No 6。4.如权利要求2或3所述的组合物,其特征在于,检测PTGER4基因的引物和探针选自组合3、组合4和组合5中的一种;组合3引物:SEQ ID No 7,探针:SEQ ID No 8,引物:SEQ ID No 9;组合4引物:SEQ ID No 10,探针:SEQ ID No 11,引物:SEQ ID No 12;组合5引物:SEQ ID No 13,探针:SEQ ID No 14,引物:SEQ ID No 15。5.如权利要求2~4中任一项所述的组合物,其特征在于,检测FOXL2基因的引物和探针为组合6或组合7;组合6引物:SEQ ID No 16,探针:SEQ ID No 17,引物:SEQ ID No 18;组合7引物:SEQ ID No 19,;探针:SEQ ID No 20,引物:SEQ ID No 21...

【专利技术属性】
技术研发人员:周光朋马竣韩晓亮王建铭
申请(专利权)人:博尔诚北京科技有限公司博诚研究中心
类型:发明
国别省市:北京;11

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