一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法。本发明专利技术的疫苗毒株为gE基因自然缺失的变异株弱毒，能够有效应对当前猪伪狂犬病的流行形势；采用生物反应器悬浮培养工艺培养病毒，可以在细胞培养罐进行大规模培养，同批次产量大、质量稳定均一；采用新型耐热冻干保护剂进行疫苗冻干，能彻底改变兽用活疫苗低温保存的缺点，这对于疫苗的保存、运输、使用提供了极大的便利。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的一种猪急性传染病。猪伪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。(邓仕伟，汪勇，薛春芳。我国伪狂犬病流行现状及新特点[J].动物医学进展，2006,27(9)：105-107)(Tamba M,Calabrese R,Finelli E,et al.Risk factors for Aujeszky,s-disease seropositivity of swine herds of a region of northern Italy[J].Prev Vet Med,2002,54(3):203-212)。我国于上世纪70年代从匈牙利引进了PRV Bartha-K61株，该病毒株是公认的优良疫苗株，上世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该疫苗进行防治，对猪伪狂犬病起到了很好的控制作用。但是，自2011年以来，在我国华北、华中、华东、东北等地区的许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似猪伪狂犬病的流行，发病猪场数量多，损失较大，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。通过对发病猪群组织器官中PRV病毒的序列分析及致病性研究，科学家发现猪伪狂犬病病毒的抗原性发生了一定程度的变异，变异伪狂犬毒株对猪的致病性更强。(赵鸿远，等.猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征.中国预防兽医学报，1008-0589(2014)07-0506-04)。我公司在为猪场提供疾病诊断的过程中，从送检病料中分离到一株gE基因自然缺失的变异株弱毒HZ株。我们用HZ株作为制苗用毒株，在对HZ株进行安全性、免疫原性等研究的基础上，进行了猪伪狂犬病活疫苗的研制，并对疫苗的安全性、效力和免疫期等进行试验，综合分析各种试验数据，本疫苗安全性高、免疫原性良好，能够有效应对当前猪伪狂犬病的流行形势。
技术实现思路
本专利技术的目的是研制一种猪伪狂犬病流行毒株弱毒活疫苗，以应对目前国内猪伪狂犬病毒病流行形势。本专利技术的技术方案：1.一种猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株，该毒株已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912。2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述猪伪狂犬病病毒HZ株gE基因自然缺失。3.如权利要求1、2所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述猪伪狂犬病病毒HZ株gB基因207-208位是CG、276-277位是CG、在269位后有连续3个碱基CGG的插入。4.如权利要求1、2或3所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述猪伪狂犬病病毒HZ株gD基因824位后有连续6个碱基CAGGCC的插入。5.如权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于其制备方法是将所述猪伪狂犬病病毒HZ株接种ST细胞进行悬浮培养，收获病毒培养物，加适宜耐热冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。具体实施方式一、生产用病毒株的分离鉴定1.病毒分离(1)病料处理称取病料组织，按1:5比例加入MEM培养基匀浆研磨，反复冻融3次，4000r/min离心10min；收上清，过滤除菌。(2)病料接种将上述上清液接种已长成单层的ST细胞，1ml/瓶，并设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱吸附1h后，弃去接种液，用MEM维持液洗一遍，然后加入MEM维持液，置37℃、含5％CO2培养箱培养观察96～120小时，出现CPE，则冻融3次收毒。(3)病毒纯化及病毒含量测定1)病毒纯化将病毒用MEM维持液10倍系列稀释至10-10，取10-3～10-10 8个稀释度的悬液接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％CO2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第一次纯化病毒。取第一次纯化病毒接种已长成单层的ST细胞进行增殖，病变达到80％左右时，冻融3次，取上清用MEM维持液10倍系列稀释，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％CO2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第二次纯化病毒。按照上述方法将病毒再纯化一次，所得到的纯化病毒即为三次纯化的病毒命名为猪伪狂犬病病毒HZ株，测定TCID50后，置-70℃以下保存备用，该株病毒已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912。2)病毒含量测定将毒液用含2％新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释度，分别接种长成良好单层ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。同时设不接毒对照8孔，置37℃、含5％CO2培养箱中培养、观察96～120小时，记录细胞病变(CPE)的孔数。按Reed-Muench法计算TCID50。2.病毒鉴定(1)PCR鉴定1)引物设计根据GenBank发表的PRV gB、gE基因序列，设计扩增部分gB、gE基因片段的引物如下：扩增gB基因的引物：扩增片段大小为600bp。gB-P1:5’-GGATCCGCGC ACGTGAACGA CAT-3’23(序列1)；gB-P2:5’-AAGCTTGAGC GCGTGCAGCT GGTT-3’24(序列2)。扩增gE基因的引物：扩增片段大小为298bp。gE-P1:5’-GCCCACGCAC GAGGACTACT ACGA-3’24(序列3)；gE-P2:5’-TTAAGCGGGG CGGGACATCA ACAG-3’24(序列4)。2)PCR扩增提取病毒DNA，分别用以上2对引物进行PCR扩增和电泳检测。(2)特异性鉴定将毒液稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合，经37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将毒种稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120小时。记录有无细胞病变。(3)生物学特性鉴定1)对氯仿敏感性试验在病毒液中加入氯仿，使其终浓度为4.8％，在4℃冰箱中震荡混匀10min，500r/min离心5min，吸取上层液体，测定病毒含量。同时设不加氯仿对照，测定病毒含量，若二者的对数差大于2，说明该病毒对氯仿敏感。2)对乙醚敏感性试验在病毒液中加入乙醚，使其终本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有猪伪狂犬病病毒HZ株活病毒，该株病毒已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912。

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有猪伪狂犬病病毒HZ株活病毒，该株病毒已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912。2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述猪伪狂犬病病毒HZ株gE基因自然缺失。3.如权利要求1、2所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述猪伪狂犬病病毒HZ...

【专利技术属性】
技术研发人员：禚宝山，魏联果，周忠涛，王蕾，徐龙涛，吴昊，李营，张广，孙旭燕，董海曼，张丹，王瑾，高洁，王彬申，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37