抗原活化的免疫细胞及其培养方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗原活化的免疫细胞及其培养方法和应用。本发明专利技术抗原活化的免疫细胞培养方法包括如下步骤：采集患者的外周血单个核细胞的步骤和将所述单个核细胞与肿瘤抗原和/或细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养的步骤。本发明专利技术抗原活化的免疫细胞用于制备细胞治疗肿瘤药物。本发明专利技术抗原活化的免疫细胞培养方法全程采用无血清培养基，有效避免了任何可能的外源性感染；抗原特异性强，多种细胞被激活，作用更接近人体抗肿瘤作用的整体效应，培养时间短。本发明专利技术抗原活化的免疫细胞和细胞治疗肿瘤药物能够在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体的涉及一种抗原活化的免疫细胞及其培养方法和其应用。
技术介绍
DC细胞又称树突状细胞，是一种具有高效杀伤活性的异质性细胞群，其在外人体周血淋巴细胞中的比例为1％～5％，临床证实，DC经大量扩增后，具有显著杀伤肿瘤和清除病毒的活性，且DC在机体细胞免疫和体液免疫中起重要调控作用。DC细胞免疫疗法是生物治疗中最重要组成部分，其过程是提取患者自身的免疫细胞在体外活化、修饰、增殖后回输患者体内，诱导机体产生特异性或非特异性的免疫应答，在患者体内发挥杀灭肿瘤细胞和抗病毒作用。由于DC免疫细胞本身的生物特性，决定了其自2011年以来较理想、较成熟的肿瘤生物治疗用途。DC细胞治疗方案的优势主要体现在以下4个方面。1、效率性，有效率高：DC细胞治疗技术是继干扰素以来，首次把总有效率提高到70％以上的生物治疗。2、无毒副作用，用自己的抗癌细胞对抗肿瘤。DC细胞疗法通过生物工程技术提取患者自身细胞经培养、增殖、修饰后回输到患者体内，不会产生排异反映，无毒副作用，变耐药性，安全有效。3、安全性，所有细胞均在国际认证的GMP实验室培养安全可靠。4、不易复发，DC细胞具有永久记忆功能，和天花疫苗一样DC能长期记忆肿瘤信息，能长期刺激抗癌系统对肿瘤发动攻击。虽然DC治疗方案具有许多优点，但是DC细胞培养存在下述不足：1.培养的细胞种类单一；2.培养周期相对较长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种抗原活化的免疫细胞及其培养方法，以解决现有DC细胞培养存在培养的细胞种类单一；2.培养周期相对较长的技术问题。本专利技术另一目的在于提供一种抗肿瘤药物，以克服现有其他细胞治疗药物存在外源性感染、培养获取时间长从而耽误患者肿瘤播散的风险。为了实现上述专利技术目的，作为本专利技术的一个方面，提供了一种抗原活化的免疫细胞培养方法。本专利技术培养方法包括如下步骤：采集患者的外周血单个核细胞；将所述单个核细胞与肿瘤抗原和细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养；其中，所述肿瘤抗原包括前列腺癌特异性的抗原蛋白(PSA)、黑色素瘤特异性的抗原(MAGE-3)、NY-ESO-1中的至少一种，所述细胞因子包括IL-2，IL-14，G-CSF中的至少一种。作为本专利技术的另一方面，提供了一种抗原活化的免疫细胞。所述抗原活化的免疫细胞是采用本专利技术抗原活化的免疫细胞培养方法培养获得。作为本专利技术的再一方面，提供了一种细胞治疗肿瘤药物，其特征在于：包含有有效剂量的本专利技术抗原活化的免疫细胞。与现有技术相比，本专利技术抗原活化的免疫细胞培养方法具有以下优点：1.全程采用无血清培养基，有效避免了任何可能的外源性感染；2.抗原特异性强，采用重组表达的肿瘤特异性抗原，可大量制备，避免了采用肿瘤组织作为抗原时抗原量的不确定性，同时，针对不同的肿瘤类型可采用不同的肿瘤抗原；3.多种细胞被激活，作用更接近人体抗肿瘤作用的整体效应：本专利技术培养
方法获得的抗原活化的免疫细胞以抗原递呈细胞为中心，同时包括大量抗原特异性活化的抗肿瘤T淋巴细胞等，是一个以抗原在体外启动抗肿瘤免疫，输入体内后触发后续一系列级联、网络化免疫反应，在体内重新活化以杀伤性T细胞及其抗肿瘤细胞因子为主，以NK/NKT、甚至体液免疫为辅的多条抗肿瘤免疫途径。4.培养时间短：整个制备时间缩短至48小时以内，极大的保持了效应细胞的活性和增殖能力。突破了传统基于树突状细胞或T淋巴细胞治疗，克服了原有制备手段复杂、效应细胞老化、增殖能力下降，体内生存时间短以及由此导致的制备时间长和费用昂贵的缺点，具有明显的创新优势。同时，由于培养时间短，回输方便，大大减小了患者采样后等待治疗的时间，避免了潜在的大量采集血细胞后患者肿瘤免疫失调、导致肿瘤扩散的可能。本专利技术抗原活化的免疫细胞由于本专利技术培养方法培养获得，本专利技术细胞治疗肿瘤药物含有本专利技术抗原活化的免疫细胞，因此，本专利技术抗原活化的免疫细胞和细胞治疗肿瘤药物能够在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。这样，本专利技术抗原活化的免疫细胞的特异性既包括针对多种抗原表位的多表位特异性，又包括针对每种抗原表位的多种效应手段(杀伤性T细胞、Th1、细胞因子、NK/NKT、体液等)，这种良好的特异性具有优秀的抗肿瘤作用。附图说明图1为本专利技术实施例抗原活化的免疫细胞培养方法的工艺流程图；图2为本专利技术实施例1诱导扩增的抗原活化的免疫细胞进行体外刺激机体分泌抗肿瘤的细胞因子的凝胶电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，
对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一方面，本专利技术实施例提供了一种抗原活化的免疫细胞培养方法。在一实施例中，所述抗原活化的免疫细胞培养方法流程如图1所示，其包括如下步骤：S01：采集患者的外周血单个核细胞；S02：单个核细胞活化培养：将所述单个核细胞与肿瘤抗原和细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养。在上述本专利技术实施例抗原活化的免疫细胞培养方法中，抗原活化的免疫细胞(Antigen Activated Immune Cells，AAIC)，在本专利技术实施例中，其是通过白细胞分离技术从患者的血液中收集大量具有抗肿瘤潜能的单个核细胞(以单核细胞和淋巴细胞为主)，通过特殊的分离、纯化、培养、用肿瘤特异性抗原刺激获得的大量细胞。这些细胞包含以树突细胞为核心的多种活化的效应细胞(如肿瘤靶标特异性杀伤性T细胞)，回输到病人体内后会诱导靶标特异性的抗肿瘤免疫反应，从而达到识别肿瘤和清除肿瘤的作用。其中，上述步骤S01中，作为本专利技术的一实施例，外周血单个核细胞的采集可以但不仅仅按照如下方法：首先通过白细胞分离技术获得患者的白细胞，再采集获得外周血单个核细胞。在一实施例中，该白细胞分离技术可以是本领域常规的白细胞分离技术，在具体实施例中，可以直接采用白细胞分离机进行分离和收集患者的白细胞。在另一具体实施例中，分离和收集患者的白细胞的数量可以控制在(1-3)×109个。在另一实施例中，采集获得外周血单个核细胞可以是采用密度法离心收集外周血单个核细胞。在进一步实施例中，在将步骤S01的采集的单个核细胞加入步骤S02所述无血清培养基中进行活化培养之前，还包括对所述单个核细胞进行培养前质控
检查的步骤，如图中的步骤S01’。在具体实施例中，所述培养前质控检查的步骤S01’包括活细胞计数、无菌检测和FACS分析步骤。其中，所述活细胞计数的方法-采用血球计数板计数；无菌检测的方法-采用凝胶法测定细菌内毒素；FACS分析的方法-采用流式细胞仪分析细胞表型。通过增设前期质控检查的步骤，从而对活细胞数量和细胞类型，以保证单个核细胞的活力，从而进一步提高AAIC的活化率。上述步骤S02中，采用重组表达的肿瘤特异性抗原，一方面可大量制备，避免了采用肿瘤组织作为抗原时抗原量的不确定性。另一方面针对不同的肿瘤类型可采用不同的肿瘤抗原，即针对每一种肿瘤类型，AAIC均使用其特异性的肿瘤抗原。针对每一种肿瘤类型，AAIC使用的肿瘤抗原具有多种特异性，活化针对多种蛋白质抗原、多肽抗原。在一实施例中，加入无血清培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗原活化的免疫细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：采集患者的外周血单个核细胞；将所述单个核细胞与肿瘤抗原和细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养；其中，所述肿瘤抗原包括前列腺癌特异性的抗原蛋白、黑色素瘤特异性的抗原、NY‑ESO‑1中的至少一种，所述细胞因子包括IL‑2、IL‑14、G‑CSF中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种抗原活化的免疫细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：采集患者的外周血单个核细胞；将所述单个核细胞与肿瘤抗原和细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养；其中，所述肿瘤抗原包括前列腺癌特异性的抗原蛋白、黑色素瘤特异性的抗原、NY-ESO-1中的至少一种，所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF中的至少一种。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述肿瘤抗原为所述NY-ESO-1，且所述细胞因子包括IL-14、G-CSF；或所述肿瘤抗原为所述前列腺癌特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF；或所述肿瘤抗原为所述黑色素瘤特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF。3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：在所述活化培养的过程中，所述肿瘤抗原的终浓度为500-1000U/ml，所述IL-2的终浓度为500-1000u/ml，所述IL-14的终浓度为10-50ng/ml，所述G-CSF的终浓度为50-150ng/ml。4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述肿瘤抗原为所述NY-ESO-1，且所述细胞因子包括IL-14、G-CSF时，在所述活化培养的过程中，所述NY-ESO-1的终浓度为1000U/ml，所述IL-14的终浓度为10ng/ml，所述G-CSF的终浓度为100ng/ml；所述肿瘤抗原为所述前列腺癌特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF时，在所述活化培养的过程...

【专利技术属性】
技术研发人员：田耕，夏燕，毕冬梅，李小燕，肖奕丹，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44