本发明专利技术属于生物电化学技术领域，具体涉及一种基于动态三明治结构的电化学传感器及其制备和应用。本发明专利技术所述电化学生物传感器，由电极、信号链和反应体系组成，电极采用金电极，信号链为一段单链DNA，DNA链的5’端修饰有巯基，DNA链的3’端修饰有亚甲基蓝，通过巯基与金电极表面自组装形成金‑巯键立于金电极表面，反应体系中含有DNAzyme与必须的反应缓冲体系，DNAzyme可以与信号链互补配对并将其切割成两段DNA短链，DNAzyme上标记有靶蛋白识别元件，可用于定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用，本发明专利技术操作简单，操作者无需特别训练，适合于偏远地区及资源贫乏地区使用。
【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术属于生物电化学
，具体涉及一种基于动态三明治结构的电化学传感器及其制备和应用。二、
技术介绍
在人蛋白质组中大约存在65万种蛋白质相互作用对，这些蛋白质分子彼此间的相互作用控制着细胞绝大多数的活动，破译这些蛋白质分子的相互作用网络不仅可以更加深入的理解这些蛋白质是如何发挥功能并最终影响细胞活动，而且有助于人们设计更加特异性的药物分子来治疗特定的疾病。因此，在生物基础研究领域对于发展灵敏、操作友好的分析方法来检测这些蛋白质间的相互作用事件有着内在的迫切要求。目前，已有多种研究蛋白质间相互作用的方法被开发出来。比如，免疫共沉淀法作为测定蛋白质相互作用的金标准，被广泛使用多年(Barrios.R.M.,Brown,K.R.,Ozdamar,B.,Bose,R.,Liu,Z.,Donovan,R.S.,Shinjo,F.,Liu,Y.,Dembowy,J.&Taylor,I.W.High-Throughput Mapping of a Dynamic Signaling Network in Mammalian Cells.Science 2005,307,1621)。但是免疫共沉淀法往往需要结合蛋白印迹法或者质谱法才能获得最后的结果，过多的实验步骤使得整个方法耗时耗力，大大降低了分析效率。蛋白片段互补检测法是细胞内蛋白质相互作用原位成像一个强有力的工具(Kerppola,T.K.Bimolecular Fluorescence Complementation(Bifc)Analysis as a Probe of Protein Interactions in Living Cells.Ann.Rev.Biophys.2008,37,465)。然而，靶蛋白上需要融合被切断的报告酶(绿色荧光蛋白或荧光素酶等)，这些报告酶片段很可能会干扰两种蛋白质之间的相互作用，得到假阳性结果。至于表面等离子共振法，核磁共振法和等温滴定量热法等(Kerppola,T.K.Bimolecular Fluorescence Complementation(Bifc)Analysis as a Probe of Protein Interactions in Living Cells.Ann.Rev.Biophys 2008,37,465；Vaynberg,J.&Qin,J.Weak Protein-Protein Interactions as Probed by NMR Spectroscopy.Trends Biotechnol.2006,24,22；Ronkainen,N.J.,Halsall,H.B.&Heineman,W.R.Electrochemical Biosensors.Chem.Soc.Rev.2010,39,1747)，由于需要昂贵的大型仪器设备，极大的限制了它们在许多领域的应用，特别是在资源匮乏的地区。因
此，如何开发更加灵敏、简单、高效的方法来分析复杂生物环境下的蛋白质分子间的相互作用就变得十分重要。电化学技术由于其固有的简单，灵敏，便携和经济等性质被广泛用于各种生物分子的检测中。尽管存在这些优点，利用电化学技术研究蛋白质相互作用仍处于探索阶段，而且经常面临灵敏度和精确度不足的问题。近年来，随着DNA纳米技术的发展，将生物电化学技术和DNA纳米技术相结合，开发各项性能更加优异的生物传感器成为了新的热点(Li,C.,Li,X.,Wei,L.,Liu,M.,Chen,Y.&Li,G.Simple Electrochemical Sensing of Attomolar Proteins Using Fabricated Complexes with Enhanced Surface Binding Avidity.Chem.Sci.2015,6,4311)。三、
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用的生物传感器及其制备方法和应用。本专利技术充分利用DNA纳米技术，提出了使用电化学技术为表征手段的蛋白质定量和蛋白质间相互作用研究方案，以求达到成本更低、快速简单的检测复杂生物环境下的蛋白质分子和蛋白质分子间相互作用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于动态三明治结构的电化学生物传感器，包括：电极、信号链和反应体系，电极采用金电极，信号链为一段单链DNA，DNA链的5’端修饰有巯基，DNA链的3’端修饰有亚甲基蓝，通过巯基与金电极表面自组装形成金-巯键立于金电极表面，反应体系中含有DNA核酶(DNAzyme)与必须的反应缓冲体系，DNAzyme可以与信号链互补配对并将其切割成两段DNA短链，DNAzyme上标记有靶蛋白识别元件。所述DNA信号链含有17个碱基，序列为5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-methylene blue-3’。所述反应体系中包括：10mM Tris-HCl，10nM DNAzyme，200mM NaCl，1mM ZnCl2，pH 7.2。所述DNAzyme序列为5’-Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3’。本专利技术所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)金电极的预处理：将金电极在水虎鱼溶液(70％浓硫酸，30％过氧化氢)
中处理10分钟，随后将电极依次用1.0μm，0.3μm的氧化铝粉末抛光，并在乙醇和纯水中超声清洗5分钟，最后将电极置于水虎鱼溶液中处理10分钟，取出冲洗，并在0.5M的硫酸中循环伏安扫描至稳定。(2)功能电极的组装：将信号链分散在DNA固定液中，滴加到处理好的金电极上，室温固定后取出电极用超纯水冲洗，MCH封闭后即可得到组装好的电极。所述步骤一中金电极为直径3mm的圆盘金电极。所述步骤二中信号链DNA浓度为0.4～2μM。所述步骤二中DNA固定液为10mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，10mM TCEP，pH 7.4。所述步骤二中DNA固定时间为1～12小时。所述步骤二中MCH封闭时间为1～4小时。所述步骤二中MCH浓度为1～5mM。本专利技术所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器用于定量检测蛋白质或蛋白质间相互作用的方法，包括以下步骤：(1)信号链修饰的金电极在-0.05～-0.5V范围内，对其进行电化学方波伏安法检测。(2)靶蛋白先与反应体系作用10分钟后滴加到信号链修饰的金电极表面，37℃孵育40分钟后，同样条件进行电化学检测。本专利技术利用了分子在界面上不同的扩散速率来实现对蛋白质分子的检测。传统的免疫传感器中广泛使用的“一抗—靶标—二抗”三明治结构一旦形成就无法改变，由于靶蛋白无法释放出来进行有效的循环，检测灵敏度受到了一定的限制。本专利技术提供了一种新的思路，利用DNAzyme的循环切割能力使得靶标蛋白可以完成多次信号转导过程，有效实现信号的增益效果。DNAzyme由于尺寸较小(直径小于2nm)，可以很容易的扩散到电极表面并与修饰在电极上面的信号链形成互补配对，然后DNAzyme发挥作用将信号链切为两半，这时双链结构变得不稳定，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于动态三明治结构的电化学传感器，其特征是由电极、信号链、反应体系和电极检测液组成，电极采用金电极，信号链为一段单链DNA，DNA链的5’端修饰有巯基，DNA链的3’端修饰有亚甲基蓝，通过巯基与金电极表面自组装形成金‑巯键立于金电极表面，反应体系中含有DNA核酶DNAzyme与必须的反应缓冲体系，DNAzyme可以与信号链互补配对并将其切割成两段DNA短链，DNAzyme上标记有靶蛋白识别元件。
【技术特征摘要】
1.一种基于动态三明治结构的电化学传感器，其特征是由电极、信号链、反应体系和电极检测液组成，电极采用金电极，信号链为一段单链DNA，DNA链的5’端修饰有巯基，DNA链的3’端修饰有亚甲基蓝，通过巯基与金电极表面自组装形成金-巯键立于金电极表面，反应体系中含有DNA核酶DNAzyme与必须的反应缓冲体系，DNAzyme可以与信号链互补配对并将其切割成两段DNA短链，DNAzyme上标记有靶蛋白识别元件。2.根据权利要求1所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器，其特征在于：DNA信号链含有16个碱基，序列为5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-Methylene blue-3’，所述DNAzyme序列为5’-Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3’，所述反应体系为10mM Tris-HCl，10nM DNAzyme，200mM NaCl，1mM ZnCl2，pH 7.2，所述电极检测液为10mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.4。3.根据权利要求1所述一种基于动态三明治结构的电化学传感器的制备方法，其特征是由以下步骤构成：(1)金电极的预处理：将直径3mm的圆盘金电极在水虎鱼...
【专利技术属性】
技术研发人员：李根喜，李超，马洁桦，胡晓璐，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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