辣椒抗炭疽病分子标记及应用制造技术

本发明专利技术涉及分子标记领域，具体涉及辣椒抗炭疽病分子标记及应用。其与侧翼SNP标记UN02856_633的遗传距离为3.468cM。本发明专利技术提供的分子标记实现了在苗期对辣椒植株绿果期抗炭疽病鉴定，大大缩短了育种时间，节约了人力物力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子标记领域，具体涉及辣椒抗炭疽病分子标记及应用。
技术介绍
辣椒(Capsicum spp)又名海椒、番椒、辣子、辣茄等，属茄科(solanaceae)辣椒属(Capsicum)，我国是世界辣椒种植面积最大的国家，辣椒炭疽病在辣椒上发生较为普遍，是危害辣椒果实的一种主要病害，辣椒炭疽病危害时间长、经济损失大，在高温多雨的气候条件下尤为严重。在我国，引起辣椒炭疽病的病原菌主要有4个种：尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum(Simmonds)、红色炭疽菌C.gloeosporioides(Penz.)Penz.and Sacc.、黑点炭疽菌C.capsici(Syd.)Butler and Bisby和黑色炭疽菌C.coccodes(Wallr.)S.Hughes。辣椒炭疽病防治中化学防治容易污染环境、物理防治高耗能且效果不明显，因此培育抗病品种是防治炭疽病的一种有效方法，利用传统的育种方法一般易受环境影响且时间长、效率低，开发与抗病基因连锁的分子标记，利用分子标记辅助选择育种是近年发展起来的高效育种手段。有研究表明，辣椒对炭疽病的抗性在绿果期和红果期不同，可能受到多个基因的影响。Lin等(2007)研究了辣椒“0038-9155”(由PBC932衍生)对尖孢炭疽菌的抗性遗传，结果表明，在绿熟果期的抗性由两个互补的显性基因共同控制，在红熟果期的抗性由两个重叠的隐性基因控制，且这两个时期的抗性基因是相互独立的。PBC80(C.baccatum)在绿熟果期对尖孢炭疽菌抗性由一对隐性基因co4控制，而红熟果期的抗性则由一对显性基因Co5控制(Mahasuk et al.，2009b)。利用中国辣椒‘PBC932’对尖孢炭疽菌(菌株Coll-153)的抗性进行了初步遗传定位，进一步明确了其遗传规律。研究表明，PBC932对炭疽病的抗性呈现显性遗传，控制绿熟果期和红熟果期抗性的主效QTL都初步定位到了5号染色体接近末端的InDel和HpmsE116两个分子标记之间，相距9.4cM，且绿果期和红果期的抗性主效基因连锁但不位于同一基因座。通过初步定位与抗病性连锁的主效QTL，可为进一步精细定位从而开发出用于分子标记辅助选择的紧密连锁标记奠定重要基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与辣椒绿果期抗炭疽病基因AnRGO5紧密连锁的分子标记。本专利技术的另一目的是提供一种利用分子标记鉴定辣椒炭疽病抗感的方法。根据本专利技术的可用于辅助抗炭疽病AnRGO5基因选择的分子标记通过以下步骤获得。本专利技术以辣椒抗病品种PBC932和感病品种77013及其构建的BC4S1群体为试验材料，研究辅助选择辣椒绿果期抗炭疽病主效基因AnRGO5的分子标记。利用SNP标记筛选与AnRGO5基因连锁的分子标记，利用初定位到5号染色体末端与其连锁的两侧SSR和InDel标记，将其标记序列对比到辣椒CM334和ZunLa基因组数据库5号染色体上(http://passport.pepper.snu.ac.kr/？t＝PGENOME/；http://peppersequence.Genomics.cn/page/species/index.jsp)，获取两标记的物理位置，筛选出在两标记之间在亲本中有多态性的KasPar标记，共筛选出64个KasPar引物，经过初筛，其中8个在双亲及群体中表现多态性。通过与BC4S1群体抗炭疽病果实表面病斑大小的表型对应，发现该位点与侧翼SNP标记UN02856_633的距离最近，遗传距离为3.468cM，物理位置约为221.3Mb。利用该分子标记在新的群体中进行抗炭疽病鉴定，可以有效地用来辅助育种工作。KasPar标记UN02856_633在抗病材料PBC932中分型为Y型，发出HEX荧光，在感病材料77013中分型为X型，发出FAM荧光，在F1中同时发出两种荧光。本专利技术的用于特异性筛选辣椒绿果期抗炭疽病的KasPar引物，其信息如下所示。本专利技术的优点是不通过抗病性鉴定，只是在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可以判断辣椒对于炭疽病的抗性，可以广泛应用到分子标记辅助育种。本专利技术提供了分子标记UN02856_633在辣椒炭疽病抗性鉴定中的应用。本专利技术提供了分子标记UN02856_633在辣椒分子标记辅助育种中的应用。本专利技术提供的分子标记实现了在苗期对辣椒植株绿果期抗炭疽病鉴定，大大缩短了育种时间，节约了人力物力。通过利用本专利技术提供的特异性引物采用KasPar系统检测待测辣椒基因组DNA：KasPar标记UN02856_633，在辣椒感病亲本中分型结果是X型，发出蓝色荧光，在抗病亲本中分型为Y型，发出绿色荧光；F1中分型结果为杂合型，发出两种荧光。通过这个KasPar分子标记可对辣椒绿果期炭疽病抗性进行鉴定，提高了育种效率。相比较国内外已发现的其它分子标记，本专利技术的SNP分子标记UN02856_633与辣椒绿果期抗炭疽病基因AnRGO5更加紧密连锁，遗传距离分别为3.468cM，在辣椒抗炭疽病育种中有重要意义。附图说明图1显示初定位的SSR标记和InDel标记在BC4S1群体部分单株扩增结果。(a)InDel标记，(b)SSR标记。注：M：50bp marker；a：与抗病亲本条带相同；b：与感病亲本条带相同；h：含有感病和抗病亲本条带。图2显示SSR标记、InDel标记和KasPar标记与主效基因AnRGO5的连锁关系。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本专利技术以辣椒抗病品种PBC932为父本、感病品种77013为母本及其以77013作为回交亲本回交四代再自交一代构建的BC4S1群体为试验材料。实施例1 辣椒绿果期抗炭疽病品种鉴定以及与AnRGO5基因紧密连锁的分子标记UN02856_633的获得1、辣椒抗性鉴定遗传群体构建以含有尖孢炭疽病抗性主效基因AnRGO5的辣椒品系PBC932(C.chinense)及感病自交系材料77013(Capsicum annuum L.)为双亲，杂交获得F1后与父本77013连续回交四代，再自交一代获得的BC4S1作为作图群体，共528个单株。2、基因组DNA的提取取嫩叶，用CTAB法提取BC4S1所有单株、亲本及F1的基因组DNA，用Biospec-nano微量分光光度计测定浓度和质量，将浓度稀释至5ng/μl。3、BC4S1群体抗性鉴定植株果实绿熟期时对果实进行抗尖孢炭疽菌(菌株Coll-153)接种鉴定，接种方法采用针刺法，将采收的绿熟期果实洗净消毒后晾干，用微量注射器刺破果皮并注入1μL浓度为5×105/ml的孢子悬浮液，每个果实根据果实大小接种2-3个点，将接种后的果实置于铺有灭菌的湿润滤纸上并将接种点朝上，用保温膜密封于26℃培养箱中暗培养2d，后揭开保温膜盖上盖子保湿5d，湿度要持续保持在90％以上，然后测量病斑直径、调查发病率。抗性鉴定指标为总体病斑直径(O)，总体病斑直径(O)＝所有病斑直径总和/接种点数。本文档来自技高网...

【技术保护点】
与辣椒绿果期抗炭疽病基因AnRGO5紧密连锁的分子标记，其特征在于，与侧翼SNP标记UN02856_633的遗传距离为3.468cM。

【技术特征摘要】
1.与辣椒绿果期抗炭疽病基因AnRGO5紧密连锁的分子标记，其特征在于，与侧翼SNP标记UN02856_633的遗传距离为3.468cM。2.与辣椒绿果期抗炭疽病基因AnRGO5紧密连锁的分子标记的特异性检测引物，其特征在于，所述引物包括：前引物A1：5’AGAGAAGCCCAAAGAGCCCGAAAAA3’；前引物A2:5’AGAGAAGCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立浩，张宝玺，张正海，曹亚从，刘仪蔚，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11