一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，包括以下步骤：将待检测大豆疫霉菌接种于大豆叶片上，12小时后提取待检测大豆疫霉菌的总RNA；以提取的总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA反应液；采用毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R，以所得cDNA反应液为模版进行实时荧光定量PCR，如果在实时荧光定量PCR扩增过程中能够检测到无毒基因Avr1b‑1的转录，则对应的待检测大豆疫霉菌为无毒菌株，否则为毒性菌株。本发明专利技术能够快速准确的测定出待检测大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b的毒性，并为大量、快速和准确鉴定大豆疫霉菌的生理小种或致病型提供有力支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分子测定方法，尤其涉及一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法。
技术介绍
大豆疫霉菌是一种大豆上的重要病原菌，属于茸鞭生物界卵菌门卵菌纲霜霉目腐霉科疫霉属，该菌能够侵染大豆引起大豆苗期的猝倒和成株期的根腐，称为大豆疫霉根腐病。利用抗病品种、药剂拌种和土壤排水3种方法是控制大豆疫霉根腐病病害的发生的有效措施，其中利用抗病品种防治该病害是最重要也是最基本的一种方法，而监测大豆疫霉菌的毒力结构或小种组成是有效利用抗病品种进行防治的关键。大豆疫霉菌生理小种的测定通常采用国际通用的鉴别寄主通过下胚轴创伤接种法来进行。目前，已鉴定并命名55个生理小种，但更多的未被命名的新生理小种不断出现，使监测大豆疫霉菌群体的生理小种组成变化显得尤为重要。目前大豆疫霉菌对抗病基因的毒性主要采用下胚轴创伤接种法来进行测定。这种生物测定方法简单易行，但也存在着一些缺点，首先是这种方法需要使用大量的鉴别寄主大豆种子，因此鉴别寄主大豆每年都必须进行大量的扩繁；其次是需要一个能够严格控制温度、湿度和光照的温室，如果实验条件控制不严将会导致鉴别寄主大豆抗感反应不清楚而出现大量的中间类型，甚至出现错误的实验结果；另外，生物测定方法的实验周期较长，从种植鉴别寄主、接种大豆疫霉菌到出现清晰的抗感反应，一个实验流程完成需要约2周时间，如果大量出现中间类型，还需要不断的重复实验，则需要更长的时间。2006年大豆疫霉菌的全基因组测序工作圆满完成，这大大促进了大豆疫霉菌无毒基因的定位和克隆。目前已有Avr1b-1、Avr1a、Avr3a、Avr3c、Avr4/6、Avr3b、Avr1k和Avr1d等8个无毒基因被克隆出来，这些无毒基因的克隆为采用分子生物学的方法来鉴定大豆疫霉菌的生理小种提供了可能。研究发现，病原菌的无毒基因在抗病基因的选择压力下可以通过不转录无毒基因的方式来逃避抗病基因的识别，从而成功侵染宿主植物。Avr1b-1是大豆疫霉菌中克隆出来的第一个无毒基因，该基因在中国群体中的序列多态性和转录情况已被详细研究，序列多态性研究共发现4种不同类型的序列和1种片段替换的情况，转录分析显示：在侵染过程中不转录无毒基因Avr1b-1的菌株均为毒性菌株；在侵染过程中转录无毒基因Avr1b-1的菌株中，仅有无毒基因Avr1b-1碱基序列为第Ⅱ种类型的菌株为毒性菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，该方法能够快速准确的测定出待检测大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b的毒性，并为大量、快速和准确鉴定大豆疫霉菌的生理小种或致病型提供有力支持。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，包括以下步骤：将待检测大豆疫霉菌接种于大豆叶片，12小时后提取待检测大豆疫霉菌的总RNA；以提取的总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA反应液；采用毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R，以所得cDNA反应液为模版进行实时荧光定量PCR，如果在实时荧光定量PCR扩增过程中能够检测到无毒基因Avr1b-1的转录，则对应的待检测大豆疫霉菌为无毒菌株，否则为毒性菌株；所述毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R的核苷酸序列如下：AVR1BR2F：5ˊ-GAGCTCATGAAGAGGACGAT-3ˊ(如序列表中的序列1)；AVR1BR2R：5ˊ-TCTTATCCAGGCTGTACCCC-3ˊ(如序列表中的序列2)。进一步地，所述提取待检测大豆疫霉菌的总RNA的步骤为：将待检测大豆疫霉菌在10％V8液体培养基上培养5天；用灭菌双层纱布过滤收集培养5天的大豆疫霉菌丝体，用蒸馏水冲洗3次后紧贴在大豆叶片的正反面，保湿培养12h，然后用滤纸吸干水份放入研钵中加液氮研碎，采用总RNA提取试剂盒提取待检测大豆疫霉菌的总RNA；所述的10％V8液体培养基通过以下方式制得：在每100mL用纱布过滤后的V8蔬菜汁中加入0.2g碳酸钙，加蒸馏水补足至1000mL，分装在三角瓶中，121℃灭菌20min。进一步地，所述逆转录的反应体系及操作程序为：在PCR管中加入提取的总RNA2μl，逆转录引物OligodT(18)1μl，浓度为10mmol/L的dNTP 1μl，重蒸水8μl，通过离心使总RNA、逆转录引物OligodT(18)、dNTP和重蒸水充分混匀，65℃加热5min后冰置5min；继续向PCR管中加入5×First Strand Buffer 4μl，0.1mol/L的二硫苏糖醇2μl，RNA酶抑制剂1μl，混匀后37℃反应2min，迅速加入1μl逆转录酶在50℃条件下反应50min；最后在70℃加热5min终止反应；冷却后得到cDNA反应液，置于-20℃保存备用。进一步地，以大豆疫霉菌的ActinA为内标基因进行实时荧光定量PCR，内标基因特异性引物ACTAF/ACTAR的核苷酸序列分别为：ACTAF：5ˊ-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3ˊ(如序列表中的序列3)ACTAR：5ˊ-CCACCACCTTGATCTTCATG-3ˊ(如序列表中的序列4)。进一步地，所述实时荧光定量PCR的反应体系和条件为：反应体系：PCR反应混合液10μL，10μmol/L毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R各0.4μL，cDNA反应液2μL,双蒸馏水7.2μL；反应条件：95℃预热2min；然后95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环。检测原理及有益效果：在侵染过程中不能正常转录无毒基因Avr1b-1的菌株，经提取侵染过程中的待检测大豆疫霉菌的总RNA并逆转录，得到的cDNA反应液中必然不含无毒基因Avr1b-1，因此在后续实时荧光定量PCR过程中也检测不到无毒基因Avr1b-1的转录；在侵染过程中能正常转录无毒基因Avr1b-1的菌株，经提取侵染过程中的待检测大豆疫霉菌的总RNA并逆转录，得到的cDNA反应液中必然含有无毒基因Avr1b-1，采用毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R进行实时荧光定量PCR，毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R能够与第Ⅰ种和第Ⅳ种类型的无毒基因Avr1b-1相结合而不能与第Ⅱ种类型的无毒基因Avr1b-1相结合，从而使携带第Ⅱ种类型无毒基因Avr1b-1的菌株在实时荧光定量PCR检测不到无毒基因Avr1b-1的转录；本专利技术通过提取侵染过程中的待检测大豆疫霉菌的总RNA、逆转录、实时荧光定量PCR等步骤，并根据实时荧光定量PCR过程中能否检测到无毒基因Avr1b-1的转录来间接判断大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b的毒性，因此，本专利技术提供的分子方法仅需要少量的感病大豆，检测时间较短(一般5天左右即可完成)，测定过程中不出现中间类型，从而避免进行不断的重复实验来消除中间类型，而且具有很高的准确性，适合大量、快速、准确的大豆疫霉菌毒性测定。附图说明图1是本专利技术涉及的四种类型无毒基因Rps1b的核苷酸序列及特异性引物结合位点示意图；图中四种类型无毒基因Rps1b的核苷酸序列按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ依次对应序列表中的序列5、序列6、序列7、序列8；图中的点表示与第Ⅰ种序列对应的核苷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，其特征在于：包括以下步骤：将待检测大豆疫霉菌接种于大豆叶片上，12小时后提取待检测大豆疫霉菌的总RNA；以提取的总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA反应液；采用毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R，以所得cDNA反应液为模版进行实时荧光定量PCR，如果在实时荧光定量PCR扩增过程中能够检测到无毒基因Avr1b‑1的转录，则对应的待检测大豆疫霉菌为无毒菌株，否则为毒性菌株；所述毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R的核苷酸序列如下：AVR1BR2F：5ˊ‑GAGCTCATGAAGAGGACGAT‑3ˊ；AVR1BR2R：5ˊ‑TCTTATCCAGGCTGTACCCC‑3ˊ。
【技术特征摘要】
1.一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，其特征在于：包括以下步骤：将待检测大豆疫霉菌接种于大豆叶片上，12小时后提取待检测大豆疫霉菌的总RNA；以提取的总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA反应液；采用毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R，以所得cDNA反应液为模版进行实时荧光定量PCR，如果在实时荧光定量PCR扩增过程中能够检测到无毒基因Avr1b-1的转录，则对应的待检测大豆疫霉菌为无毒菌株，否则为毒性菌株；所述毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R的核苷酸序列如下：AVR1BR2F：5ˊ-GAGCTCATGAAGAGGACGAT-3ˊ；AVR1BR2R：5ˊ-TCTTATCCAGGCTGTACCCC-3ˊ。2.根据权利要求1所述的一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，其特征在于：所述提取待检测大豆疫霉菌的总RNA的步骤为：将待检测大豆疫霉菌在10%V8液体培养基上培养5天；用灭菌双层纱布过滤收集培养5天的大豆疫霉菌丝体，用蒸馏水冲洗3次后紧贴在大豆叶片的正反面，保湿培养12小时，然后用滤纸吸干水份放入研钵中加液氮研碎，采用总RNA提取试剂盒提取待检测大豆疫霉菌的总RNA；所述的10%V8液体培养基通过以下方式制得：在每100mL用纱布过滤后的V8蔬菜汁中加入0.2g碳酸钙，加蒸馏水补足至1000mL，分装在三角瓶中，121℃灭菌 20 min。3.根据权利要求1所述的一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：王源超，崔林开，王晓莉，董莎萌，郑小波，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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