碳水化合物富集的重组微生物制造技术

本公开涉及经过改造而用于增强所需碳水化合物的生产的重组微生物，以及尤其可用作动物饲料成分的相关生物质和组合物。本公开还提供相关方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表参考与此同时根据37C.F.R.§1.821以计算机可读形式(CRF)通过EFS-Web作为文件名200206_416WO_SEQUENCE_LISTING.txt以电子方式提交的“序列表”以引用的方式并入本文。序列表的电子副本创建于2015年1月16日，并且占用磁盘大小为277千字节。专利
本公开涉及新型重组C1代谢微生物以及相关组合物和方法，该新型重组C1代谢微生物包含用于增强碳水化合物生产的经过改造的代谢途径。背景动物饲料利用中效率的提高已在过去数十年中通过使用饲料添加剂得以实现。这些添加的物质增加动物饲料组合物的营养含量、能含量和/或抗病性质。对商业动物生产商日益严峻的挑战是谷物成本的上涨。成本上涨部分归因于对用于生物燃料和人类食品使用的谷物的竞争性需求。随着谷物和蛋白组分成本上涨，加上可用于饲料生产的土地有限，具有有益的营养和抗病性质的可替代的低成本动物饲料产品将是非常理想的。专利技术概要在一个实施方案中，本公开提供一种重组C1代谢微生物，其包含选自由以下组成的组的外源性核酸：编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶
的核酸的表达控制序列的核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化成所需碳水化合物。通常，天然气来源的碳原料是天然气或甲烷。在另一个实施方案中，本公开提供一种来源于本公开的重组C1代谢微生物的生物质。在又一个实施方案中，本公开提供一种包含从本公开的生物质提取的碳水化合物的碳水化合物组合物，其中所述组合物展现出小于-30‰的δ13C。在再一个实施方案中，本公开提供一种包含本公开的生物质的动物饲料。在另一个实施方案中，本公开提供一种包含本公开的生物质或组合物的培养基或发酵培养基。本公开还提供相关方法。详述本公开提供具有利用相对低成本的碳原料作为能源的能力的新型重组C1代谢微生物以及相关生物质、组合物和方法。本公开的重组微生物经过改造用于商业上可取的某些碳水化合物的增强的生产。这些重组微生物以及来源于它们的生物质和碳水化合物组合物用作动物(例如像，家畜、鱼类、家禽等)以及培养微生物或发酵微生物的营养来源。在一个实施方案中，本公开提供一种重组C1代谢微生物，其中所述重组C1代谢微生物包含选自由以下组成的组的外源性核酸：编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列的核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气碳原料转化成碳水化合物。如本文
所更加详细地描述的，当这些重组微生物在天然气来源的C1基质存在下培养时，它们通常展现出小于-30‰的δ13C，并且常常小于-40‰。通产，重组微生物为非光合C1代谢微生物。在这些实施方案中，本公开的重组微生物经过改造以将天然气来源的原料转化成更有价值的碳水化合物，与更昂贵的碳水化合物相比，天然气来源的原料成本相对较低并且资源丰富(例如，天然气或C1基质，诸如来自天然气的甲烷)。如本文所用，术语“天然气来源的原料”是指天然气或从天然气分离的任何组分(包括C1基质)或由天然气转化的任何组分(即，合成气)。术语“天然气”在本文是指可通过常规方法(例如，多孔储层的钻孔和注水法)或非常规方法(例如，具有低透气性的地层的水力压裂、水平钻孔或定向钻孔)获得的天然存在的气体混合物。气体混合物由甲烷和其他化合物(包括其他C1化合物)以及其他低碳烷烃气体(例如像，乙烷、丙烷、丁烷、戊烷等)、二氧化碳、氮气、硫化氢等及其组合组成。非常规天然气可获自例如像以下的来源：致密砂岩气，其形成于砂岩或碳酸盐岩中；煤层甲烷，其形成于煤藏中并吸附于煤炭颗粒中；页岩气，其形成于细粒度页岩中并吸附于粘土颗粒中或保留于小空隙或微裂缝内；甲烷水合物，其是在低温和高压下在诸如海洋下和永久冻土的地点中形成的天然气和水的结晶组合。如本文使用，术语“C1基质”或“C1化合物”是指缺少碳-碳键的任何含碳分子或组合物。示例性C1基质包括合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸或其盐、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺类(例如，甲胺、二甲胺、三甲胺等)、甲基化硫醇类、甲基卤素(例如，溴甲烷、氯甲烷、碘代甲烷、二氯甲烷等)、氰化物或其任何组合。在本公开的某些实施方案中，天然气来源的原料可为天然气、来自天然气的C1基质或合成气。通常，C1基质为甲烷。已利用天然气来源的碳基质作为原料的示例性重组C1代谢微生物展现出不同的同
位素碳标记，这在本文中进行了更加详细的描述。这种显著的同位素碳标记还通过此类重组微生物的组合物和产物(例如，生物质、碳水化合物组合物等)来展现。在另一个实施方案中，本公开提供一种包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸的重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物能够将甲烷转化成碳水化合物。示例性碳水化合物为葡聚糖。在一些实施方案中，碳水化合物为β-(1,3)-葡聚糖，并且可为支化或非支化的或其组合。通常，C1代谢微生物为非光合C1代谢微生物。如本文使用，“C1代谢微生物”或“C1代谢非光合微生物”是指具有使用C1基质作为能量来源或作为其主要的能量和生物质来源的能力，并且可或可不使用其他碳基质(诸如糖和复杂碳水化合物)获得能量和生物质的任何微生物。例如，C1代谢微生物可氧化C1基质，诸如甲烷或甲醇。C1代谢微生物包括细菌(诸如甲烷氧化菌和甲基营养菌)和酵母。在某些实施方案中，C1代谢微生物不包括光合微生物，诸如藻类。在一些实施方案中，C1代谢微生物将为“专性C1代谢微生物”，意指其唯一的能量来源为C1基质。在其他实施方案中，C1代谢微生物(例如，甲烷氧化菌)将在C1基质原料存在下培养(即，使用C1基质作为能量来源)。本公开的重组C1代谢微生物经过改造而用于所需碳水化合物的增强的生产，并且在一个实施方案中，包含编码碳水化合物生物合成(CB)酶的外源性核酸。术语“碳水化合物生物合成酶”和“CB酶”在本文可互换地使用以指涉及通过重组宿主C1代谢微生物进行的碳水化合物的生产的酶。编码用于本公开的实践中的CB酶的外源性核酸通常经过密码子优化以在重组宿主C1代谢微生物中最佳表达，并且编码原生自与所述宿主C1微生物异源的物种或者作为存在于自然界中的酶的突变体(即，变体)的酶。如本文所用，术语“碳水化合物”是指单糖、二糖或多糖。用于本公开的实践中的适合的外源性核酸包括编码涉及单糖，例如像葡萄糖、果糖、核糖、甘油醛、半乳糖等；二糖，例如像乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖(cellulobiose)等及其混合物；或多糖，包括例如非支化或支化的葡聚糖等及其混合物的生产的酶的那些外源性核酸。实例性葡聚糖包括α-葡聚糖，例如像右旋糖酐、糖原、支链淀粉、淀粉等以及β-葡聚糖，例如像β-1,4-葡聚糖(即，纤维素)、β-1,3-葡聚糖、β-(1,3)(1,4)-葡聚糖、β-(l,3)(l,6)-葡聚糖等及其混合物。在具体实施方案中，CB酶是涉及非支化或支化的葡聚糖或其混合物的生产的酶。已知β-葡聚糖具有有益的治疗性质，包括作为强力的免疫兴奋剂以及良性和恶性肿瘤的强力拮抗剂。还已知β-葡聚糖降低胆固醇和甘油三酸酯水平。参见，D.Akramiené等,Medicina(kaun本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组C1代谢微生物，其包含选自由以下组成的组的外源性核酸：编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列的核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化成所需碳水化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.16 US 61/928,3661.一种重组C1代谢微生物，其包含选自由以下组成的组的外源性核酸：编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列的核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化成所需碳水化合物。2.如权利要求1所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶。3.如权利要求1-2中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的原料是天然气。4.如权利要求1-3中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的原料是甲烷。5.如权利要求1-4中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述重组C1代谢微生物能够产生所述所需碳水化合物，所产生的水平大于天然C1代谢微生物所产生的水平至少10％。6.如权利要求1-5中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物是甲烷氧化菌。7.如权利要求1-6中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述所需碳水化合物选自由多糖、二糖和单糖组成的组。8.如权利要求7所述的重组C1代谢微生物，其中所述所需碳水化合物是多糖，所述多糖是β-葡聚糖。9.如权利要求1-8中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述β-葡聚糖选自由以下组成的组：β-(1,3)-葡聚糖、β-(1,3)(1,6)-葡聚
\t糖、β-(1,3)(1,4)-葡聚糖、β-(1,4)-葡聚糖和β-(1,6)-葡聚糖。10.如权利要求8-9中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶是葡聚糖合酶。11.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码作为糖异生酶的碳水化合物生物合成酶。12.如权利要求11所述的重组C1代谢微生物，其中所述糖异生酶选自由以下组成的组：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、A型醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶、己糖激酶和葡糖-6-磷酸。13.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码作为糖原生成酶的碳水化合物生物合成酶。14.如权利要求13所述的重组C1代谢微生物，其中所述糖原生成酶选自由以下组成的组：葡糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、糖原合成酶和1,4-α-葡聚糖分支蛋白。15.如权利要求1-14中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于细菌是内源性的碳水化合物生物合成酶。16.如权利要求1-14中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于选自由酵母、真菌和植物组成的组的生物体是内源性的碳水化合物生物合成酶。17.如权利要求1-14中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于选自由大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌组成的组的微生物是内源性的碳水化合物生物合成酶。18.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶具有与选自由以下SEQ ID NO组成的组的参照序列至少90％相同的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·西尔弗曼，L·J·吉维尔，J·米勒，R·M·萨维尔，D·D·瑞基兹盖，
申请(专利权)人：凯利斯塔公司，
类型：发明
国别省市：美国;US