本发明专利技术公开了一种用于制备检测禽腺病毒4型试剂盒的引物对及其应用，该引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了一种包含所述引物对的试剂盒以及检测禽腺病毒4型的方法。所述引物对能特异地扩增出样品中的禽腺病毒4型的Hexon基因片段，检测灵敏度高，最低检测限达7.2×10‑4ng/μL，结果准确，可将其应用到对禽腺病毒4型的检测和鉴定当中；引物对对禽腺病毒4型的不同毒株的检测具有通用性；本发明专利技术建立的一种快速、特异、准确的禽腺病毒4型的检测方法，为今后对该病的流行检测和防控提供检测工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于制备检测禽腺病毒4型试剂盒的引物对及其应用。
技术介绍
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一种无囊膜的双链DNA病毒，可分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三群，其中Ⅰ群FAdV有12个血清型(FAV1～12)。Ⅰ群禽腺病毒的不同血清型对禽类的致病性各有不同，快速准确区分Ⅰ群禽腺病毒的不同血清型对临床诊断和治疗有十分重要的意义。禽腺病毒编码的主要结构蛋白有六邻体(Hexon)、五邻体(基体、IIIa)、纤突、pVⅠ、pVⅡ、pVⅢ。已证实六邻体蛋白带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，可以引发极强的中和反应，当六邻体被替代或突变将导致中和免疫缺失。因此，Hexon蛋白对诊断Ⅰ群禽腺病毒的感染有着重要意义。李海英等(2011)对12个血清型毒株进行了Hexon全基因序列测定和聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析。利用三对引物(A、B、C)分别进行Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型毒株的Hexon全基因序列PCR扩增，并进行序列测定和PCR-RFLP分析，研究表明，Hexon基因全长为2800左右个核苷酸，编码约940个氨基酸，不同血清型之间的同源性在75.2％-99.5％，变异范围是0.5-34.6％。推导的氨基酸同源性在20.7％-98.8％，差异性在1.1％-213.0％。12个血清型之间Hexon全基因序列信息用来评价Ⅰ群禽腺病毒家族的种系发育关系，构建的进化树显示出五个主要的分支。选用限制性内切酶HaeⅡ，利用片段D特异性可以有效区分大部分血清型。Ⅰ群FAdV的12个血清型均可导致包涵体肝炎，但只有4型腺病毒(FAdV4)会引起心包积液，该病称为肝炎-心包积液综合征，也称安卡拉病。该病早在1985年就已见有散发病例，1987年3月在巴基斯坦卡拉奇附近的安卡拉地区一个肉鸡场发生暴发性流行。安卡拉病就由此而得名。该病主要危害3～6周龄肉鸡，而后备母鸡和蛋鸡只偶尔发生。该病潜伏期短，发病急，发病之后迅速波及全群。发育良好的鸡群发病严重。发病率高，群体发病率100％，个体平均发病率30％，严重的鸡群发病率高于80％。死亡率高，平均死亡率10％，极少数严重的鸡群死亡率高达60％。安卡拉病在我国通常只是零星爆发。但是2012年以来，该病在我国全国范围内报导病例上升，2015年6月以来更是在江苏、安徽、山东、辽宁、河南、内蒙古等地大规模地流行和爆发该病，给我国的养鸡业带来了很大的经济损失。因此，建立一种特异、敏感和快速的病原检测方法对于禽腺病毒4型的鉴定具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一个引物对，该引物对能特异性地扩增出禽腺病毒4型的Hexon的基因片段，能够用于快速鉴定禽腺病毒4型。引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述引物对是根据禽腺病毒高度保守的结构蛋白Hexon的基因设计合成的，对禽腺病毒FAdV4不同毒株的检测具有通用性。本专利技术提供了一种所述引物对的PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)DNA提取试剂，包括Digestion Buffer、BD Buffer、Proteinase K、PW Solution、WashSolution以及Elution Buffer，来自生工UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒。(2)PCR反应试剂，包括20U/μL的ExTaq酶、10mM的上下游引物，2.5mM的dNTP、10×PCR buffer；所述上游引物为5'-ATACCAACACGAGCACCTC-3'；下游引物为5'-TTATCCCTGAACCCGATG-3'；(3)阳性对照，可选用本实验室分离的FAdV4ZJ2015-1毒株的核酸样品，以该核酸样品为模板，利用上述引物对进行PCR扩增获得403bp的产物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，序列分析表明扩增的DNA片段为Hexon基因片段；(4)阴性对照，正常鸡胚尿囊液中提取的DNA。本专利技术提供了一种所述引物对在制备检测禽腺病毒4型试剂盒中的应用。本专利技术提供了一种检测禽腺病毒4型的方法，包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)建立PCR反应体系，以所述总DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测；如扩增产物中出现403bp的条带，则说明待测样品中含有禽腺病毒4型，否则，说明待测样品中不含禽腺病毒4型。所述待测样品为禽类胚尿囊液或离体病理组织。所述离体病理组织为病死禽类的肝脏、脾脏等易分离的组织。从病死禽类中解剖得到的待测样品进行预处理，再用于PCR扩增。作为优选，所述禽类为鸡。所述PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液终浓度为1×，ExTaq酶1.0U，dNTP各0.2mM，上下游引物各0.4mM，所述的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。PCR反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35
个循环，72℃延伸10min。以上述PCR反应体系及反应条件，对禽腺病毒4型核酸的最低检测限为0.0072ng/μL。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点：(1)本专利技术的引物对能特异地扩增出样品中的禽腺病毒4型的Hexon基因片段，检测灵敏度高，最低检测限达7.2×10-4ng/μL，结果准确，可将其应用到对禽腺病毒4型的检测和鉴定当中。(2)本专利技术的引物对对禽腺病毒4型的不同毒株的检测具有通用性。(3)本专利技术建立了一种快速、特异、准确的禽腺病毒4型的检测方法，为今后对该病的流行检测和防控提供检测工具。附图说明图1为本专利技术禽腺病毒4型PCR扩增结果图，其中M为DNA marker；1为ZJ2015-1分离株阳性结果；2和3为阴性对照。图2为实施例3的禽腺病毒4型PCR特异性扩增结果图，其中M为DNA marker；1-3为禽腺病毒4型3个分离株(ZJ2015-1、ZJ2015-2，ZJ2015-3)感染尿囊液核酸抽提物PCR结果；4-9分别为减蛋下降综合征病毒(腺病毒1型)、pAeasy-1腺病毒载体(腺病毒5型)、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病毒核酸抽提物PCR结果。图3为实施例4的禽腺病毒PCR检测敏感性结果图，其中M为DNA marker；1，7.2×103ng/μL；2，7.2×102ng/μL；3，7.2×101ng/μL；4，7.2×100ng/μL；5，7.2×10-1ng/μL；6，7.2×10-2ng/μL；7，7.2×10-3ng/μL；8，7.2×10-4ng/μL；9，7.2×10-5ng/μL；10，7.2×10-6ng/μL；11，7.2×10-7ng/μL。图4为实施例5试剂盒的临床样品检测结果，其中M为DNA marker；1-7为7份鸭临床样品的PCR检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明，但下述实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术的范围。本专利技术利用的试剂盒组成包括：(1)DNA提取试剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种包含如权利要求1所述引物对的PCR检测试剂盒。3.如权利要求1所述的引物对在制备检测禽腺病毒4型试剂盒中的应用。4.一种检测禽腺病毒4型的方法，其特征在于，包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)建立PCR反应体系，以所述总DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测；如扩增产物中出现403bp的条带，则说明待测样品...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖敏，莫开昆，周继勇，郑肖娟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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