一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物促生菌技术领域，具体涉及的是一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用。一种促进带叶兜兰植株生长的菌株，其分类学命名为胶膜菌A6‑2(Tulasnella sp.)，于2016年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60034。本发明专利技术的促进带叶兜兰植株生长的菌株在促进带叶兜兰植株生长中的应用。采用本发明专利技术提供的方法促进带叶兜兰植株生长，操作简单、成本低廉。本发明专利技术对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物促生菌
，具体涉及的是一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用。
技术介绍
兜兰属(Paphiopedilum)植物，花形奇特，花色艳丽，是人们最喜爱的兰科植物之一，人们常称兜兰为“拖鞋兰”、“仙履兰”。近十几年来，由于猖獗走私以及生境破坏等原因，野生兜兰的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，不少种类已经到了灭绝的边缘。为了缓解对野生植株的采集压力，保护濒危物种，以及满足人们对兜兰属植物的需求，国内外学者对兜兰植物的人工繁殖进行了大量地研究。目前，部分兜兰种类的无菌播种和组织培养技术已获成功，但无菌苗栽培后生长缓慢，成活率低，制约着兜兰的人工繁育。在自然条件下，菌根真菌可以帮助植物度过脆弱的幼苗期长成植株，提高植株提高养分的吸收效率和逆境抵抗力。但因为兜兰属植物菌根真菌分离培养困难，尚缺乏具有较为显著的促生菌株。因此，筛选和培养具有促进兜兰植株生长的菌株对兜兰栽培和种群恢复具有重要意义。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用。本专利技术提供的菌株A6-2是从带叶兜兰根部分离得来，经形态学和分子生物学鉴定为担子菌亚门胶膜菌科的胶膜菌属(Tulasnella sp.)，已于2016年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075)，保藏号为GDMCC No.60034。本专利技术还提供了所述的菌株A6-2在促进带叶兜兰植株生长中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：1.本专利技术的菌株A6-2与带叶兜兰植株共培养可以促进幼苗发育，长出能进行光合作用的叶片，将幼苗移栽至基质培育，幼苗均能存活且生长良好。2.采用本专利技术提供的方法促进带叶兜兰育苗效率和进程，操作简单、成本低廉。本专利技术对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。保藏信息说明胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)，保藏编号为GDMCC No.60034，保藏日期为2016年5月12日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。附图说明图1为本专利技术的胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)在PDA固态培养基上的溶的菌落形态；图2为本专利技术的胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)的菌丝形态；图3为本专利技术的胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)的菌丝形态念珠状细胞形态；图4为本专利技术的胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)制备的菌剂对植株生长对比图；有关附图标记的说明：CK为未使用本专利技术的菌剂移栽后的植株；A6-2是使用本专利技术的胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)制备的菌剂移栽后的植株。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1：菌根真菌的分离鉴定和培养1.1分离及纯化培养基分离菌根真菌培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，马铃薯200g，琼脂6g，葡萄糖15g补水至1000ml，PH自然。依照常规生物学试验方法，配置分离培养基，121℃高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至45℃左右，加入链霉素(100ug/ml)和青霉素(100ug/ml)，摇匀后制备平板。1.2菌根真菌分离及纯化方法菌根真菌分离按照常规组织分离法：取带叶兜兰新鲜营养根，选取在莱卡显微镜下观察选择具有菌丝团的根段，在流水下冲洗干净，用75％酒精漂洗分别处理8min，无菌水冲洗1-2次，再用10％NaClO消毒8min，无菌水冲洗7-8次。将预处理过的根切成1-2mm的小段，然后将处理好的材料置于PDA平板上，24℃恒温培养3-5d，可见从皮层细胞内长出的菌丝长入培养基内。利用菌丝尖
端挑取法对菌株进行分离和纯化，再接到试管中保存。1.3菌根真菌的形态学鉴定观察菌株的菌落特征，包括菌落形状、大小、色泽、生长速度及菌丝、孢子梗及孢子形态等。观察发现在PDA培养基上，菌落成乳白色，早期菌丝紧贴培养基生长，部分侵入培养基内，边缘不规则；后期可产生大量气生菌丝，并形成小颗粒状菌丝团，菌落成铁褐色；菌丝生长极快约2.5d左右即可长满培养皿；菌丝有隔，呈直角分枝，近分支处有隔，菌丝融合程度高；念珠状菌丝较多，长椭圆形；不产生孢子。分子鉴定方法：菌丝的收集：将菌株接种至PDA液体培养基摇菌7-10天(200rpm，25℃)，滤纸过滤收集菌丝，用于基因组提取。总DNA提取使用CTAB法。ITS区段的PCR扩增：rDNA ITS区段的扩增采用通用引物ITS1(5＇TCCGTAGGTGAACCTGCGG3＇)，ITS4(5＇TCCTCCGCTTATTGATATGC3＇)。PCR反应体系的组成为10×Buffer 5ul，10mmol/L NTP(Mg+)1ul，10u mol/L引物各1ul，模板DNA 1ul(终浓度在80ng/L左右)，Taq酶1U(0.25ul)，用无菌纯水定容至50ul。PCR反应采用BIARAD Engine型PCR仪，循环参数为：预变性95℃，4min，变性95℃，40s，退火56℃，40s，延伸72℃，45s；补平72℃，8min。共进行35个循环。产物送至北京奥科生物技术有限责任公司进行测序(使用仪器为ABI3730XL)。所得序列结果使用PRIMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性。得到序列在NCBI上BLAST。测序结果如序列表中序列1所示。将测序结果在GenBank进行在线比对，该菌株与胶膜菌属真菌(Tulasnella sp.)的相似性较高，确定分离到的菌株为胶膜菌属真菌，将其命名为菌株A6-2。实施例2：菌剂的制备及应用2.1液体菌剂制备及应用采用PDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g补水至1000mL)121℃高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至室温。接种菌株A6-2后在摇床以160-220rpm摇菌20d左右，稀释菌液200-300倍，对近期移栽的组培苗进行蘸根或灌根，约60d灌根1次。组培苗出瓶要求为根长至少在2cm以上，3片以上叶片的植株才可移栽。2.2固体菌剂制备及应用将栽培基质(松树皮约2m2大小：珍珠岩4:1)浸泡到完全水饱和后在121℃高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至室温。接种菌株A6-2制备的菌剂后在30℃放置25d左右，直至观察到树皮有乳白色后为止，将带菌基质分装后移栽组培苗。对施用菌剂(A6-2)和未施用菌剂(对照)的移栽苗在移栽后约180d，随机各选择30株进行叶片数、最长叶、根数、最长根和鲜重进行测量，结果如表1所示。表1 本专利技术的胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)制备的菌剂对带叶兜兰植株生物量的影响注：数据后不同小写字母表示0.05水平上差异显著；不同大写字母表示0.01水平上的差异显著。如表1可知，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进带叶兜兰植株生长的菌株，其分类学命名为胶膜菌A6‑2(Tulasnella sp.)，于2016年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60034。

【技术特征摘要】
1.一种促进带叶兜兰植株生长的菌株，其分类学命名为胶膜菌A6-2(Tulasnella sp.)，于2016年5月12日保藏于广东省微...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓国，周主贵，黄昌艳，闫海霞，卢家仕，李秀玲，何荆洲，李冬萍，邓杰玲，陈廷速，张自斌，卜朝阳，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院花卉研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45