一种奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌及其分离方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的目的是在奶牛粪便中分离出甲烷氧化菌的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌及其分离方法。本发明专利技术的菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.11836。本发明专利技术的有益效果是：甲烷氧化菌能够以温室气体甲烷作为碳源进行生长，对于减少甲烷产生即减少温室效应具有一定作用。甲烷氧化菌能降解卤化碳氢化合物，在自然界碳循环和工业生物技术以及环境治理中具有重要的应用价值。以甲烷氧化菌为主要成分制备益生菌制剂应用于临床，对于由反刍动物瘤胃发酵引起的甲烷废气排放及动物摄入能量的浪费起到至关重要的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
技术介绍
随着温室效应的日益加剧，温室气体研究已引起各国学者的广泛关注。甲烷是一种仅此于二氧化碳的温室气体。研究表明，甲烷（CH4）的温室效应是二氧化碳（CO2）的20 ~30倍，对全球气候变暖的影响作用占15% ~ 20% 。在全球家畜的甲烷排放量中，反刍动物占97%，而牛类（除水牛外）约占75% 。在我国，动物胃肠道发酵排放甲烷量占甲烷总排放量的29.7% 。研究认为，通常奶牛生产中有6% ~ 10%的摄入总能被转化为甲烷，以嗳气的形式排放到大气中。反刍动物甲烷的排放不仅造成了摄入量的巨大损失，同时也造成了对环境得污染。因此，如何减少反刍动物甲烷排放，对减缓气候变暖和高效利用饲料具有重要现实意义。反刍动物排放甲烷与其特有的消化生理特点有关。反刍动物可通过瘤胃和后肠发酵产生甲烷。据估测，约94％的甲烷是由瘤胃产生的。反刍动物瘤胃中有大量纤维分解菌、产甲烷菌和其他厌氧微生物，饲料进入瘤胃后首先进行厌氧发酵，微生物将碳水化合物和其他植物纤维发酵分解成挥发性脂肪酸、氢气和二氧化碳等，而产生的二氧化碳、甲酸、乙酸、甲胺和次甲胺等在甲烷生成菌的作用下合成甲烷。甲烷很难被自身消化利用，产生的甲烷主要以嗳气的方式通过其口腔和鼻孔释放，肠道产生的甲烷约90%通过血液循环到肺部，也是通过口腔排出，而其余10%的甲烷则由肛门排出。瘤胃内甲烷的调控主要通过卤代物及其衍生物、微生物调控和饲料添加剂的调控。其中，卤化物及其类似化合物是反刍动物体内CH4生成的有效抑制剂，如三氯乙烷、三氯乙炔、溴氯甲烷等，均对产甲烷菌有毒害抑制作用，可抑制20% ~ 80%的CH4产生。水合氯醛在瘤胃中转化成氯仿，氯仿可以降低CH4的生成，但是水合氯醛损坏肝脏、长期饲喂会引起动物中毒，甚至死亡，所以不运用于实际生产中。饲料添加剂则多含抗生素，在畜产品中产生大量残留，对人体健康造成严重威胁，越来越多的消费者反对其在日粮中的使用。最为安全与高效的则是微生物调控，瘤胃内微生物主要包括原虫、乙酸菌、甲烷氧化菌等。大量研究表明甲烷氧化细菌能够以甲烷作为唯一碳源和能源进行生长，将甲烷(或甲基化合物)同化为细胞碳，并在此过程中获得生长所需的碳源和能量。甲烷氧化菌氧化瘤胃内甲烷的途径有两条，一条是通过由乙醛酸到丝氨酸的途径，另一条是甲醛结合在磷酸核糖上生成6—磷酸阿洛酮糖的途径。通过甲烷氧化菌利用甲烷生长是减少反刍动物瘤胃及胃肠道甲烷排放的一个重要途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是在奶牛粪便中分离出甲烷氧化菌的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌及其分离方法。本专利技术的菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.11836。本专利技术的菌剂，其活性成分为奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌表达菌株，CGMCCNo.11836。本专利技术的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其培养基组成成分重量份为：A液：KH2PO4 0.8~1.1、Na2HPO4˙12H2O 2.8~3.0、MgSO4˙7H2O 0.30~0.34、(NH4)2SO4 2 2.8~3.2；微量元素B液：MgSO4˙7H2O 2.8~3.2、MnSO4˙2H2O 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeSO4˙7H2O0.08~1.02、CaCl2˙2H2O 0.08~1.02、ZnSO4˙7H2O 0.08~1.02、CuSO4˙5H2O 0.008~0.012、AlK(SO4)2 0.008~0.012、H3BO3 0.008~0.012、Na2MoO4˙2H2O 0.008~0.012；将A液、B液按99:1的比例进行混合，作为甲烷氧化菌的无机盐培养基。本专利技术的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其分离方法是：a、样本采集：取奶牛场营养状况良好、无患病健康奶牛的新鲜粪便20g于含有200 mlNMS培养基的无菌瓶中，充分震荡、混匀转移实验室备用；b、取步骤a获得的混合液体充分振荡，用纱布过滤，以10%接种量接种，一次培养：取滤液20 ml 于含有200 ml灭菌NMS液体培养基的锥形瓶中，用橡胶塞塞紧密封，每天向培养瓶中加入甲醇200 սl；摇床条件：170r/min、37℃空气摇床培养；二次培养：取上述菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇200 սl，用橡胶塞塞紧密封，空气摇床170r/min、37℃以甲醇为唯一碳源进行培养；三次培养：培养4-5天到达菌液对数生长期，取上述变粉菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇200 սl，用橡胶塞塞紧密封，空气摇床170r/min、37℃以甲醇为唯一碳源进行培养；c、甲烷氧化菌的纯化培养：⑴NMS固体培养基的制备：取配制好的NMS液体培养基与琼脂粉以1.5%~2%比例进行混合，121℃高压蒸汽灭菌20min，将灭菌好的培养基在超净工作台中倒入玻璃平皿中，待平皿中培养基凝固即为NMS固体培养基；⑵甲烷氧化菌平板划线分离：取步骤b经过三次富集培养过程中处于对数期生长的甲烷氧化菌菌液转移至灭菌的1.5ml离心管中，封盖备用；打开离心管，将无菌接种环伸入菌液中，沾取一环菌液，打开平皿，将沾有菌液的接种环在固体培养基的第一区域上划三至五条平行线；取新的无菌接种环，从第一区域划线的末端开始往第二区域划三至五条平行线；如此重复以上操作在第三、第四、第五区域进行划线；划线完毕后将甲醇加至平皿盖，倒置平皿放入37℃恒温箱中培养，底部甲醇挥发为甲烷氧化菌生长提供碳源；d、24小时候即生长出甲烷氧化菌。本专利技术的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，菌液基因组DNA序列为SEQ ID NO：1。本专利技术的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，菌液基因组DNA的提取：①取1~3 mL细菌培养液，12000g离心2分钟；倒掉培养基，加入180 μLTE缓冲液悬浮菌体，加入18 μL 50mg/mL溶菌酶和5 μL RNA酶，30℃中静置15~30分钟；5000g离心5分钟，倒掉上清，预留10 μL上清液；加入25 mg GlassBeads和200 μL Buffer TL，悬浮细胞，最大速度涡漩5分钟，静置，使玻璃珠沉淀于管底，转移上清至1.5 mL离心管中；加入25 μL蛋白酶K，涡漩10秒，瞬时离心；将混合液置于50℃振荡培养箱中温浴30分钟，如果没有振荡培养箱，期间每隔2~3分钟瞬时涡漩一次以混匀；加入220 μL Buffer BL，涡漩混匀，65℃温浴10分钟；加入220 μL无水乙醇，涡漩20秒混匀；将DNA吸附柱插入收集管中，转移所有混合液到吸附柱中，10000g离心1分钟结合DNA，丢弃收集管和废液；将吸附柱放入另一收集管中，加入500 μLBuffer KB，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入650 μLDNAWashBuffer，10000xg离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入450 μLDNAWashBuffer，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中；10000g开盖离心2分钟以干燥吸附膜；将吸附柱放入1.5 mL离心管，加入50~100 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.11836。
【技术特征摘要】
1.一种奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.11836。2.一种菌剂，其活性成分为奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌表达菌株，CGMCC No.11836。3.权利要求1所述奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其特征在于：其培养基组成成分重量份为：A液：KH2PO4 0.8~1.1、Na2HPO4˙12H2O 2.8~3.0、MgSO4˙7H2O 0.30~0.34、(NH4)2SO4 2 2.8~3.2；微量元素B液：MgSO4˙7H2O 2.8~3.2、MnSO4˙2H2O 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeSO4˙7H2O0.08~1.02、CaCl2˙2H2O 0.08~1.02、ZnSO4˙7H2O 0.08~1.02、CuSO4˙5H2O 0.008~0.012、AlK(SO4)2 0.008~0.012、H3BO3 0.008~0.012、Na2MoO4˙2H2O 0.008~0.012；将A液、B液按99:1的比例进行混合，作为甲烷氧化菌的无机盐培养基。4.权利要求1所述奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其特征在于：其分离方法是：a、样本采集：取奶牛场营养状况良好、无患病健康奶牛的新鲜粪便20g于含有200 mlNMS培养基的无菌瓶中，充分震荡、混匀转移实验室备用；b、取步骤a获得的混合液体充分振荡，用纱布过滤，以10%接种量接种，一次培养：取滤液20 ml 于含有200 ml灭菌NMS液体培养基的锥形瓶中，用橡胶塞塞紧密封，每天向培养瓶中加入甲醇200 սl；摇床条件：170r/min、37℃空气摇床培养；二次培养：取上述菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇200 սl，用橡胶塞塞紧密封，空气摇床170r/min、37℃以甲醇为唯一碳源进行培养；三次培养：培养4-5天到达菌液对数生长期，取上述变粉菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇200 սl，用橡胶塞塞紧密封，空气摇床170r/min、37℃以甲醇为唯一碳源进行培养；c、甲烷氧化菌的纯化培养：⑴NMS固体培养基的制备：取配制好的NMS液体培养基与琼脂粉以1.5%~2%比例进行混合，121℃高压蒸汽灭菌20min，将灭菌好的培养基在超净工作台中倒入玻璃平皿中，待平皿中培养基凝固即为NMS固体培养基；⑵甲烷氧化菌平板划线分离：取步骤b经过三次富集培养过程中处于对数期生长的甲烷氧化菌菌液转移至灭菌的1.5ml离心管中，封盖备用；打开离心管，将无菌接种环伸入菌液中，沾取一环菌液，打开平皿，将沾有菌液的接种环在固体培养基的第一区域上划三至五条平行线；取新的无菌接种环，从第一区域划线的末端开始往第二区域划三至五条平行线；如此重复以上操作在第三、第四、第五区域进行划线；划线完毕后将甲醇加至平皿盖，倒置平皿放入37℃恒温箱中培养，底部...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘国文，刘欢，李心慰，王哲，李小兵，赵晨旭，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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