本发明专利技术涉及一种猪CD40L/GMCSF/PCV2 Cap重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法，步骤如下：S1依次将CD40L、GM‑CSF和Cap连接到载体pUC57，命名为pUC‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S2将CD40L、Cap和GM‑CSF连到pShuttle‑CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，命名为PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S3将构建好的PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF线性化后与骨架质粒pAdEasy‑1电转BJ5183，挑菌、摇菌、提质粒，单酶切鉴定；S4鉴定正确后使用试剂盒提取质粒，转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌PBS；S5反复冻融后，离心取上清，此病毒即为重组腺病毒；S6将得到的重组腺病毒进行扩增；S7纯化重组腺病毒。本发明专利技术首次将猪肿瘤坏死因子相关激活蛋白基因和猪粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子基因同时加入到腺病毒载体中提高表达PCV2 Cap重组腺病毒免疫原性。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种猪CD40L/GMCSF/PCV2 Cap重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法，步骤如下：S1依次将CD40L、GM?CSF和Cap连接到载体pUC57，命名为pUC?CD40L?Cap?GMCSF；S2将CD40L、Cap和GM?CSF连到pShuttle?CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，命名为PS?CD40L?Cap?GMCSF；S3将构建好的PS?CD40L?Cap?GMCSF线性化后与骨架质粒pAdEasy?1电转BJ5183，挑菌、摇菌、提质粒，单酶切鉴定；S4鉴定正确后使用试剂盒提取质粒，转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌PBS；S5反复冻融后，离心取上清，此病毒即为重组腺病毒；S6将得到的重组腺病毒进行扩增；S7纯化重组腺病毒。本专利技术首次将猪肿瘤坏死因子相关激活蛋白基因和猪粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子基因同时加入到腺病毒载体中提高表达PCV2 Cap重组腺病毒免疫原性。【专利说明】一种猪CD40L/GMCSF/PCV2CaP重组腺病毒的构建、扩増及纯化 方法
[00011 本专利技术涉及动物病毒基因工程
，具体涉及一种猪CD40L/GMCSF/PCV2Cap 重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法。
技术介绍
腺病毒具有易感性强、致病力低、宿主范围广、稳定性好、易进行操作、病毒滴度 高、易于浓缩和贮存以及介导基因转移效率高、能容纳较大基因片段等优点，而且其生物学 背景已研究得相当清楚，因而腺病毒载体在疫苗制备，癌症、传染病和遗传病的基因治疗等 方面被广泛研究和应用，被认为是基因转移中最有前途的载体之一。腺病毒载体能高效表 达外源基因，并能对外源蛋白进剪切、糖基化、磷酸化等反应后加表达的蛋白具有天然蛋白 的特性，可用于制药、基因工程疫苗、基因治疗以及肿瘤治疗等领域，已展现出良好的应用 前景。重组腺病毒可以通过注射、口服、气管接种等途径进行免疫，接种动物不仅产生体液 免疫和细胞免疫，而且还可以产生局部黏膜免疫应答，对预防呼吸道、消化道的感染具有极 其重要的意义。但是腺病毒本身也有一些缺点限制了它的应用。 虽然腺病毒载体有许多优点，但是人腺病毒载体和动物及禽类腺病毒载体在临床 应用中遇到的问题主要是来自于腺病毒本身表达的病毒蛋白质引起宿主的免疫反应，感染 细胞丢失，外源基因表达短暂等。所以如何降低腺病毒本身的免疫反应，并且保持其原有的 优点、发挥细胞因子分子佐剂的功能，从而提高重组腺病毒的免疫原性，降低免疫剂量成为 限制其应用的主要问题所在。 CD40L(CD40Ligand，CD154)，又名TRAP(TNF_related activation protein)，是肿 瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员之一<XD40是其受体，CD40与CD40L的 相互作用不仅在体液免疫中扮演重要角色，而且在调节细胞介导的免疫应答中也发挥重要 的作用。一方面CD40-CD40L交联对B细胞的活化、增殖，抗体的产生以及Ig类别转换，起了非 常重要的作用。另一方面⑶40-CD40L交联可促进⑶4+T细胞自身被活化，表达⑶25、⑶40L增 高，促进IL-12的分泌，而后者参与CTL的产生以及诱导T细胞向Th 1细胞因子分化（分泌 IFN-γ)〇 粒细胞-巨·细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF)是一个具有多种潜能的造血生长因子，不仅能刺激造血祖细胞增殖、分化 和成熟并从骨髓向外周转移，而且还能活化中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells, DC)及其他单核细胞，在细胞因子网络中占有重要地位。GM-CSF能够诱导造血前体细 胞分化增殖，维持造血前体细胞和成熟血细胞(粒细胞系和单核细胞系）的存活，增强树突 状细胞的活性和生物学功能，促进皮肤中朗罕氏细胞的分化增殖，吸引DC向注射部位集聚 和成熟，并提高其抗原递呈能力，从而起到增强疫苗免疫效果的作用。 猪圆环病毒可引起猪圆环病毒病(Porcine Circovirus disease，PCVD)或猪圆环 病毒相关性疾病(Porcine Circovirus-associated disease，PCVAD)，如引起仔猪的传染 性先天性震颤和断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)等多种疾病。1991年加拿大首次暴发该病，随后许多国家和地区都报道了 该病，其已给养猪业造成了严重的经济损失。1978年德国学者Tischer首次从猪肾传代细胞 系PK15中分离到该病毒，并于1982将其命名为圆环病毒，随后经血清学调查发现在德国、加 拿大、新西兰、英国、北爱尔兰、美国等国的猪群中PCV抗体阳性率很高，其中1997年C lark从 加拿大西部患有PMWS的猪群中分离到一种新的病毒该病毒与PK15细胞中圆环病毒相似，并 命名为猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)〇 PCV2感染引起几种综合征和疾病，包括PMWS、猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、猪呼 吸综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、也可能引起渗出性皮炎等。目前，由PCV2感染引 起的各种疾病和综合征已遍布世界各地，已给世界养猪业带来巨大损失。 PCV2重组腺病毒已经有人进行过相关研究，但是其作为一种疫苗在使用时免疫原 性比较低。 本专利技术将猪CD40L和GM-CSF引入到重组腺病毒中，与PCV2Cap蛋白共表达，发挥 CD40L和GM-CSF分子免疫佐剂的作用，以提高重组腺病毒疫苗的免疫原性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对腺病毒表达系统的不足，提供一种提高PCV2重组腺病毒免疫 原性的猪⑶40L/GMCSF/PCV2Cap重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法。 为实现上述目的，本专利技术公开了如下技术方案： ，包括如下步 骤： S1依次将CD40UGM-CSF和PCV2Cap蛋白的编码基因连接到载体PUC57,经测序鉴 定，命名为pUC-CD40L-Cap-GMCSF; S2将CD40L、Cap和GM-CSF连到pShuttle-CMV:以pUC-CD40L-Cap-GMCSF为模板，用 带Xho I上游引物和带EcoR V下游引物进行PCR扩增，得到目的基因⑶40L-Cap-GMCSF，双酶 切后连接到pShutt le-CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，PCR鉴定和单双酶切鉴定正确后， 送测序，测序正确后，命名为PS-CD40L-Cap-GMCSF; S3将构建好的PS-CD40L-Cap-GMCSF用限制性内切酶Pme I线性化后与骨架质粒 pAdEasy-Ι电转BJ5183，挑菌、摇菌、提质粒，用限制性内切酶Pac I单酶切鉴定； S4鉴定正确后使用试剂盒提取质粒，用限制性内切酶Pac I线性化后转染HEK293A 细胞，当细胞病变出现时，收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌PBS; S5反复冻融3次后，尚心取上清，此病毒即为原种腺病毒，命名为Ad-CD40L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪CD40L/GMCSF/PCV2 Cap重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1依次将CD40L、GM‑CSF和PCV2 Cap蛋白的编码基因连接到载体pUC57，经测序鉴定，命名为pUC‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S2将CD40L、Cap和GM‑CSF连到pShuttle‑CMV：以pUC‑CD40L‑Cap‑GMCSF为模板，用带Xho I上游引物和带EcoR V下游引物进行PCR扩增，得到目的基因CD40L‑Cap‑GMCSF，双酶切后连接到pShuttle‑CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，PCR鉴定和单双酶切鉴定正确后，送测序，测序正确后，命名为PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S3将构建好的PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF用限制性内切酶Pme I线性化后与骨架质粒pAdEasy‑1电转BJ5183，挑菌、摇菌、提质粒，用限制性内切酶Pac I单酶切鉴定；S4鉴定正确后使用试剂盒提取质粒，用限制性内切酶Pac I线性化后转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌PBS；S5反复冻融3次后，离心取上清，此病毒即为原种腺病毒，命名为Ad‑CD40L‑Cap‑GMCSF。S6重组腺病毒的扩增：用收获的Ad‑CD40L‑Cap‑GMCSF病毒液接种已长成单层的HEK293A细胞，待80％以上的细胞出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)后收毒，连续传代扩增病毒，收集病毒，并测定各代次病毒滴度，根据CPE，按Reed‑Muench法计算病毒的滴度(50％tissue culture infective dose,TCID50)。S7重组腺病毒的纯化：(1)将15％CsCl和40％CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液；(2)将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；(3)超速离心，100000g，4℃，离心16h；(4)离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具感染能力；位置较低，颜色较亮的条带是活病毒颗粒。用针头将这一条带收集；(5)在TBS(10mM Tris，0.9％NaCl，pH 8.1)中透析1h，随后在含有10％甘油的TBS中透析2次，每次1h；(6)将纯化的腺病毒分装于离心管中。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：童德文，黄勇，李德龙，赵晓民，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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