蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法技术

一种蛋白质检测用融合蛋白，其为使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个蛋白质结构域与将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153G/D330N、将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成His且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153H/D330N、或将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体K328R/D330N融合而得的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法。
技术介绍
生物试样中存在各种蛋白质，作为用于对特定蛋白质进行检测、定量的方法，已知有ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，酶联免疫分析)等。ELISA是使用酶标记抗体利用抗原抗体反应定量地检测试样中所含的抗原等特定蛋白质的方法，是免疫检查等中通用的方法之一。ELISA中，已知的是直接吸附法、三明治法、竞争法等。例如，使针对吸附于固相表面的目标物质(抗原)的一抗通过抗原抗体反应进行结合。洗去未反应的一抗后，添加带有酶标记的标记二抗，再次通过抗原抗体反应进行结合。在其中洗去未反应的标记二抗、添加显色底物时，与抗原的量成比例地引起显色反应。通过吸光光度计等对所生成的显色物质的吸光度进行测定，由使用已知浓度的标准品制作的标准曲线能够对抗原的量进行定量。但是，这样的方法中，对于与目标物质(抗原)特异性结合的一抗，需要与其特异性结合的标记二抗，在检测多种目标物质(抗原)时，需要准备分别与多种一抗特异性结合的标记二抗，通用性差。一直以来，作为蛋白质检测用的酶，已知有碱性磷酸酶，其中，广泛使用的是CIAP(CalfIntestineAlkalinePhosphatase，小牛肠碱性磷酸酶)。CIAP是由牛的小肠纯化而得的，一直被广泛地使用，近年来，通过基因重组而制作的CIAP也有售。但是，前者生产成本高，难以保持<br>稳定的品质。此外，后者的情况下，为了降低生产成本而用酵母等表达进行生产，但是大多情况下发生糖链的过度附加、背景、粘性等问题。此外，CIAP虽然活性高，但稳定性、特别是热稳定性差，难以长期维持活性，无法用于需要加热的基因相关应用。进而，稀释时其活性也会降低，因此在长时间、以低浓度使用的实际应用中，无法充分发挥其高活性特性。BAP(BacterialAlkalinePhosphatase，细菌碱性磷酸酶)虽然稳定性高，但其活性与CIAP相比仅为数十分之一左右，活性低，因此几乎不被用于蛋白质检测中。另一方面，存在如下方法：使用通过化学反应使碱性磷酸酶等酶和G蛋白结合而得的酶标记G蛋白，来代替标记二抗。G蛋白是来自链球菌的细胞壁的蛋白质，具有与几乎所有哺乳动物的IgG发生结合的性质。若使用这样的酶标记G蛋白，则能够与多种免疫种(免疫種)的一抗结合，即使在对多种目标物质(抗原)进行检测的情况下，也可以不准备与各物质分别特异性结合的抗体，通用性高。但是，使用用碱性磷酸酶等酶标记的酶标记G蛋白的方法存在检测灵敏度低的问题。此外，也存在热稳定性差的种类，有时会在处理中失活。非专利文献1记载了：制作使G蛋白(SpG)的C1结构域结合于海萤荧光素酶的N末端的融合蛋白，但没有抗体结合能力，与在两者间插入了连接子(リンカー)GGGGS的蛋白结果相同。非专利文献2记载了G蛋白的基因序列、氨基酸序列、结构、各结构域的功能等。非专利文献3记载了对BAP的特定位置的氨基酸残基进行了置换的双重突变体、例如D153G/D330N、D153H/D330N等，对活性、稳定性、最适pH、底物、金属离子的亲和性和活性进行了考察。专利文献1中记载了对BAP的特定位置的氨基酸残基进行了置换的突变体D153G、K328R及双重突变体V99A/K328R，记载了用于三明治ELISA、竞争法等用途。专利文献2中记载了BAP的第329位、第330位、第153位/第328位的突变体，并记载了进行与抗原的融合蛋白的制作和竞争ELISA。专利文献3中记载了K328R等BAP突变体，记载了与抗体进行化学结合进行ELISA。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利第3560972号公报专利文献2:日本特开平9-098780号公报专利文献3:日本专利第2620416号公报非专利文献非专利文献1:EngineeringoffunctionalchimericproteinG-Vargulaluciferase,ANALYTICALBIOCHEMISTRY,249(2),pp.147-152(1997)非专利文献2:ExpressionandpurificationofatruncatedrecombinantstreptococcalproteinG,BiochemJ.,267(1),pp.171-177(1990)非专利文献3:ImprovingEscherichiacoliAlkalinePhosphataseEfficacybyAdditionalMutationsinsideandoutsidetheCatalyticPocket.,Chembiochem.,2,pp.517-523,(2001)
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术在于，提供一种通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质检测用融合蛋白及使用其的蛋白质检测方法。用于解决课题的手段本专利技术为一种蛋白质检测用融合蛋白，其为使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153G/D330N、将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成His且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153H/D330N、或将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体K328R/D330N融合而成的。此外，前述蛋白质检测用融合蛋白中，前述蛋白质结构域优选A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域结合而成的结构域。此外，本专利技术为一种蛋白质检测方法，使前述蛋白质检测用融合蛋白和对象物中存在的蛋白质直接或间接结合，对所结合的前述蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分作为标记部分进行检测。专利技术效果本专利技术中，通过使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N融合，从而能够提供一种通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质检测用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质检测用融合蛋白，其特征在于，是使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个蛋白质结构域与双重突变体D153G/D330N、双重突变体D153H/D330N、或双重突变体K328R/D330N融合而成的，所述双重突变体D153G/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体，所述双重突变体D153H/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸残基Asp置换成His、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体，所述双重突变体K328R/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.18 JP 2013-2170481.一种蛋白质检测用融合蛋白，其特征在于，是使包含G蛋白的C1
结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个蛋白质
结构域与双重突变体D153G/D330N、双重突变体D153H/D330N、或双重
突变体K328R/D330N融合而成的，
所述双重突变体D153G/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第
153位的氨基酸残基Asp置换成Gly、且将第330位的氨基酸残基Asp置
换成Asn的双重突变体，
所述双重突变体D153H/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第
153位的氨基酸残...

【专利技术属性】
技术研发人员：神谷典穗，松叶恭一，永井贤治，林浩之辅，
申请(专利权)人：国立大学法人九州大学，株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：日本;JP