一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因技术领域，具体公开了一种检测融合基因MLL‑ENL mRNA表达的试剂盒及其应用。所述的试剂盒包含MLL‑ENL反应液以及ABL反应液；所述的MLL‑ENL反应液中包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物以及如SEQ ID NO:3所示的MLL‑ENL的寡核苷酸探针；所述的ABL反应液中包含如SEQ ID NO:4所示的正向引物、如SEQ ID NO:5所示的反向引物、如SEQ ID NO:6所示的ABL的寡核苷酸探针。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明专利技术的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融合基因MLL‑ENL mRNA进行定量检测。

Reagent kit for detecting fusion gene MLL-ENL mRNA expression and application thereof

The present invention relates to the field of gene technology, a detection of MLL fusion gene expression ENL mRNA kit and application specific public. The kit includes the MLL ENL reaction liquid and ABL reaction liquid; containing MLL ENL reaction liquid in the forward primer, such as SEQ ID NO:1 shows such as SEQ ID reverse primer NO:2 shows such as SEQ ID and NO:3 MLL shown ENL oligonucleotide probe; the ABL reaction liquid contains a forward primer, such as SEQ ID NO:4 shown as oligonucleotide probe reverse primer, SEQ ID NO:5 shown as shown in SEQ ID NO:6 ABL. The kit has high sensitivity and specificity, by the kit of the invention realizes the peripheral blood or bone marrow samples of MLL fusion gene ENL mRNA quantitative detection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因
，具体涉及一种检测融合基因MLL-ENLmRNA表达的试剂盒及其应用。
技术介绍
11q23染色体易位是急性髓系白血病(AcuteMyelogenousLeukemia,AML)常见的核型改变，分子学研究表明，在30余种11q23易位相关的基因融合中，均涉及到MLL基因重排，此类异常是位于11q23的混合系白血病（Mixedlineageleukemia,MLL）基因发生重排。MLL基因位于11号染色体长臂2区3带（11q23），是目前血液系统恶性疾病中常累及的基因之一，在急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia,ALL)和AML中均有发生，特别是AML-M1,M2,M4,M5。该基因易位重排在AML中的发生率为5%～8%，在ALL中的发生率为7%～10%，在婴幼儿白血病中的发生率为60%～70%。此类型中常见的MLL-ENL基因融合是由t(11;19)(q23;p13.3)染色体易位而形成的，其编码的蛋白产物能够遗传性的指导淋巴系祖细胞转化成为髓系细胞，这表明该融合蛋白具有影响造血谱系的能力。t(11;19)(q23;p13.3)易位引起MLL基因（lysine(K)methyltransferase2A，也称为KMT2A基因）和ENL基因（myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia;translocatedto,1也称为MLLT1基因）的融合MLL基因的断裂位点位于第9、10外显子之间，ENL基因的断裂位点为第2个外显子上游，目前最为常见的融合方式为MLL第10个外显子与ENL第2个外显字融合形成的MLL-ENL基因。MLL-ENL蛋白调控的靶基因有HOXA9/MEIS1和转录因子EYA1、SIX1和SIX4。其中EYA蛋白已知能与SIX蛋白家族成员形成异二聚体，提示了EYA1/SIX1很可能是急性白血病中MLL融合蛋白介导的一种新的致病通路。研究人员进一步通过造血细胞转化实验证明了EYA1与SIX1协同作用能使造血祖细胞在体外永生化。常见于小于1岁的婴幼儿，中位存期为17.6月。目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。Real-TimePCR技术是今年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置（CCD）的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法Real-TimeRT-PCR技术是Real-TimePCR的一种（YuqiZ,MinY,JohannWM,etal.2002.QuantificationofhumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralDNAbyUsingTaqManTechnology.JCliMicrobiol.40（2）：675-678；DrostenC,SeifriedE,RothWK,etal.2001.TaqMan5-nucleasehumanimmunodeficiencyvirustype1PCRassaywithphage-packagedcompetitiveinternalcontrolforhigh-throughputblooddonorscreening.JClinMicrobiol,39:4302-4308;SchuurmanR,DescampsD,WeverlingGJ,etal.Multicentercomparisonofthreecommercialmethodsforquantificationofhumanimmunodeficiencyvirustype1RNAinplasma.JClinMicrobiol.1996Dec;34(12):3016-22;ChristophersonC,KidaneY,ConwayB,etal.PCR-Basedassaytoquantifyhumanimmunodeficiencyvirustype1DNAinperipheralbloodmononuclearcells.JClinMicrobiol.2000Feb;38(2):630-4.），它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的Real-TimePCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中的上述问题，提供一种检测融合基因MLL-ENLmRNA表达的试剂盒及其应用。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本专利技术的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融合基因MLL-ENLmRNA进行定量检测，检测急性髓系白血病(AML)及急性淋巴细胞白血病（ALL）等血液系统肿瘤中融合基因MLL-ENLmRNA的表达水平。本专利技术所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：一种检测融合基因MLL-ENLmRNA表达的试剂盒，包含MLL-ENL反应液以及ABL反应液；所述的MLL-ENL反应液中包含如SEQIDNO:1所示的正向引物、如SEQIDNO:2所示的反向引物以及如SEQIDNO:3所示的MLL-ENL的寡核苷酸探针；所述的ABL反应液中包含如SEQIDNO:4所示的正向引物、如SEQIDNO:5所示的反向引物、如SEQIDNO:6所示的ABL的寡核苷酸探针。SEQIDNO:1~6所述的序列如下所示：SEQIDNO:15’-CCAGGGTGGTTTGCTTTCTC-3’；SEQIDNO:25’-GGGCTTCTTGCGCAGTTG-3’；SEQIDNO:35’-ATGTAGAGTGCACCGTCCAGGTGA-3’；SEQIDNO:45’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’；SEQIDNO:55’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’；SEQIDNO:65’-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-3’。优选地，SEQIDNO:3的5’含有荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测融合基因MLL‑ENL mRNA表达的试剂盒，其特征在于，包含MLL‑ENL反应液以及ABL反应液；所述的MLL‑ENL反应液中包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物以及如SEQ ID NO:3所示的MLL‑ENL的寡核苷酸探针；所述的ABL反应液中包含如SEQ ID NO:4所示的正向引物、如SEQ ID NO:5所示的反向引物、如SEQ ID NO:6所示的ABL的寡核苷酸探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测融合基因MLL-ENLmRNA表达的试剂盒，其特征在于，包含MLL-ENL反应液以
及ABL反应液；
所述的MLL-ENL反应液中包含如SEQIDNO:1所示的正向引物、如SEQIDNO:2所示的
反向引物以及如SEQIDNO:3所示的MLL-ENL的寡核苷酸探针；
所述的ABL反应液中包含如SEQIDNO:4所示的正向引物、如SEQIDNO:5所示的反向
引物、如SEQIDNO:6所示的ABL的寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQIDNO:3的5’含有荧光报告基团，3’
含有荧光淬灭基团；所述的SEQIDNO:6的5’含有荧光报告基团，3’含有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的MLL-ENL反应液中引物和探针所
用的浓度均为2~10pmol/人份。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的ABL反应液中引物和探针所用的
浓度均为2~10pmol/人份。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的MLL-ENL反应液以及ABL反应液中
还包含PCR缓冲液，所述的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KCl溶液
和3.0mmol/L的MgCl2溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含RNA提取试...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐伟杰，程春燕，秦璐，
申请(专利权)人：广州蓝吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44