生物合成途径和产物制造技术

本公开内容描述了经生物合成的化合物，其包括脱水甲羟戊酸内酯和β‑甲基‑δ‑戊内酯。本公开内容进一步描述了制备这些化合物的生物合成方法。在某些实施方案中，所述生物合成方法可包括产生β‑甲基‑δ‑戊内酯的生物合成和化学步骤的组合。最后，本公开内容描述了可用于这些化合物的生物合成的重组细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求于2013年4月18日提交的美国临时专利申请顺序号61/813,354和2013年8月15日提交的美国临时专利申请顺序号61/866,233的优先权，其各自通过引用结合到本文中。概述本公开内容一方面描述了经生物合成的化合物，其包括脱水甲羟戊酸内酯和β-甲基-δ-戊内酯。另一方面，本公开内容进一步描述了制备这些化合物的生物合成方法。在某些实施方案中，所述生物合成方法可包括产生β-甲基-δ-戊内酯的生物合成和化学步骤的组合。再一方面，本公开内容描述了可用于这些化合物的生物合成的重组细胞。本专利技术的以上概述无意描述本专利技术的每个公开的实施方案或每种实施。以下描述更具体地举例说明了说明性的实施方案。在本申请全文的若干处，通过实例列表提供指导，可以不同组合使用所述实例。在每种情况下，所记载的列表仅作为代表性的群组，而不应视为排他性的列表。附图简述图1.β-甲基-δ-戊内酯(βMδVL)的基于生物的路线。(I)全人工合成的途径。atoB:乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶；mvaS:HMG-辅酶A合酶；mvaE:HMG-辅酶A还原酶；sidI:酰基-辅酶A连接酶；sidH:烯酰-辅酶A水合酶；ter:烯酰-辅酶A还原酶。(II)混合途径。经生物合成的甲羟戊酸通过催化性脱水和氢化而转化为βMδVL。(III)中间体脱水甲羟戊酰-辅酶A可以自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯。图2.用于测试βMδVL产生而构建的质粒。图3.β-甲基-δ-戊内酯的总的基于生物的产生和该单体的半合成的路线。(A)来自MvaS和MvaE的不同组合的甲羟戊酸的发酵。I:来自粪肠球菌(E.faecalis)的MvaS,来自粪肠球菌的MvaE；II:来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的MvaS，来自粪肠球菌的MvaE；III:来自干酪乳杆菌(L.casei)的MvaS，来自粪肠球菌的MvaE；IV:来自干酪乳杆菌的MvaS，来自金黄色葡萄球菌的MvaE；V:来自干酪乳杆菌的MvaS，来自干酪乳杆菌的MvaE；VI:来自干酪乳杆菌的MvaS，来自海沼甲烷球菌(M.maripaludis)的MvaE；VII:来自干酪乳杆菌的MvaS，来自沃氏甲烷球菌(M.voltae)的MvaE。(B)用来自以下的铁载体酶SidI和SidH进行的脱水甲羟戊酸内酯发酵：A,烟曲霉(A.fumigatus)；B,粗糙脉孢菌(N.crassa)；C,颖枯壳针孢(P.nodorum)；D,油菜菌核病菌(S.sclerotiorum)。(C)通过用以下烯醇-还原酶(enoate-reductase)进行的发酵对β-甲基-δ-戊内酯的产生：1,来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的Oye2；2,来自酿酒酵母的Oye3；3,来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的野生型YqjM；4,来自枯草芽孢杆菌的突变型YqjM(C26D和I69T)。(D)在1.3L生物反应器中通过葡萄糖发酵的甲羟戊酸的产生。图4.通过折射率(RI)监测的甲羟戊酸变为脱水甲羟戊酸内酯的酸催化脱水。图5.通过硫酸催化的甲羟戊酸发酵样品脱水变为脱水甲羟戊酸内酯。(A)用不同的硫酸浓度的反应。(B)HPLC测定。图6.提取的脱水甲羟戊酸内酯的NMR谱。图7.脱水甲羟戊酸内酯的氢化样品的NMR谱。图8.产生β-甲基-δ-戊内酯(βMδVL)的替代的基于生物的路线。atoB:乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶；mvaS:HMG-辅酶A合酶；mvaE:HMG-辅酶A还原酶；sidI:酰基-辅酶A连接酶；sidH:烯酰-辅酶A水合酶；OYE2:烯醇-还原酶。图9.用于测试β-甲基-δ-戊内酯(βMδVL)的产生而构建的质粒。图10.500L发酵曲线。说明性实施方案的详述本公开内容涉及生物合成途径和具有这些途径的遗传修饰的微生物，其用于产生β-甲基-δ-戊内酯。本公开内容描述了自可再生碳源生物合成3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A的全生物合成途径。如图1所示，3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A自发地转化为终产物β-甲基-δ-戊内酯。或者，如图8所示，脱水甲羟戊酰-辅酶A自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯，其可被还原为β-甲基-δ-戊内酯。本公开内容也描述了产生β-甲基-δ-戊内酯的整合工艺，其包括将脱水甲羟戊酰-辅酶A或甲羟戊酸转化为脱水甲羟戊酸内酯，然后脱水甲羟戊酸内酯经化学加工而产生β-甲基-δ-戊内酯。目前，聚交酯(PLA)是基于生物的可再生的聚合物的实例，其具有重要的市场冲击。然而，PLA的半晶体性质限制了其应用。本公开内容描述了新的聚合物单体的新颖的发酵工艺的开发，所述单体可聚合为无定形结构。设计和构建新的合成的代谢途径天然存在的微生物代谢途径不能直接自碳水化合物碳源(例如葡萄糖)产生β-甲基-δ-戊内酯。我们已经设计和改造了β-甲基-δ-戊内酯的非天然代谢途径(图1和图8)。首先，我们将异源途径引入微生物宿主以产生非天然代谢物甲羟戊酸。(图1,路线I)。甲羟戊酸途径存在于哺乳动物和古生菌(Archaea)中，用于脂质生物合成。因为许多微生物例如大肠杆菌(E.coli)天然地具有乙酰基-辅酶A代谢池，在两步酶促步骤中可完成甲羟戊酸向脱水甲羟戊酰-辅酶A的转化。我们进一步设计和改造了涉及克隆酰基-辅酶A连接酶(sidI)和烯酰-辅酶A水合酶(sidH)的途径。最后，我们改造了微生物，以通过反式-2-烯酰-辅酶A还原酶(ter)催化而还原脱水甲羟戊酰-辅酶A的双键，形成3-甲基-5-羟基-戊酰-辅酶A。3-甲基-5-羟基-戊酰-辅酶A可以自发地环化为β-甲基-δ-戊内酯。我们也已设计了一种混合方法，以产生β-甲基-δ-戊内酯(图1，路线II)。首先，自可再生碳源生物合成甲羟戊酸。然后，经催化性脱水将甲羟戊酸转化为脱水甲羟戊酸内酯。自反应混合物中提取脱水甲羟戊酸内酯并通过催化性氢化将其还原为β-甲基-δ-戊内酯。我们也观察到中间体脱水甲羟戊酰-辅酶A可自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯(图1，路线III)，因此提供了产生β-甲基-δ-戊内酯的另一条生物合成/化学混合路线。我们也已设计了非天然途径以产生β-甲基-δ-戊内酯(图8)。在这里我们又是将异源途径引入微生物宿主以产生非天然代谢物甲羟戊酸。我们也利用了sidI和sidH的活性以产生脱水甲羟戊酰-辅酶A，其可以自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯。最后，我们将烯醇还原酶(例如，OYE2,YqjM；Bougioukou等人,2009,AdvancedSynthesis&Catalysis35本文档来自技高网...

【技术保护点】
经生物合成的脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.18 US 61/813354;2013.08.15 US 61/8662331.经生物合成的脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸化合物。
2.经生物合成的β-甲基-δ-戊内酯化合物。
3.组合物，其包含含有大于零的14C/12C比例的脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸。
4.权利要求3的组合物，其中14C/12C比例大于0.25×10?12。
5.权利要求3或4的组合物，其中14C/12C比例为0.25×10?12至1.2×10?12。
6.组合物，其包含含有大于零的14C/12C比例的β-甲基-δ-戊内酯。
7.权利要求6的组合物，其中14C/12C比例大于0.25×10?12。
8.权利要求6或7的组合物，其中14C/12C比例为0.25×10?12至1.2×10?12。
9.重组细胞，其经修饰而表现出相比野生型对照增加的脱水甲羟戊酰-辅酶A的生物合
成。
10.权利要求9的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的在培养中积累
β-甲基-δ-戊内酯的能力。
11.权利要求9或10的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的以下一种
或多种酶的活性：硫解酶、3-羟基-3-甲基-戊二酰(HMG)-辅酶A合酶、HMG-辅酶A还原酶、酰
基-辅酶A连接酶或烯酰-辅酶A水合酶。
12.权利要求11的重组细胞，其中所述硫解酶包含AtoB。
13.权利要求12的重组细胞，其中所述AtoB是由分离自大肠杆菌的多核苷酸所编码。
14.权利要求11的重组细胞，其中所述HMG-辅酶A合酶包含MvaS。
15.权利要求14的重组细胞，其中所述MvaS是由多肽所编码，所述多肽分离自肠球菌属
成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员、或甲烷球菌属成员。
16.权利要求11的重组细胞，其中所述HMG-辅酶A还原酶包含MvaE。
17.权利要求16的重组细胞，其中所述MvaE是由多肽所编码，所述多肽分离自肠球菌属
成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员、或甲烷球菌属成员。
18.权利要求11的重组细胞，其中所述酰基-辅酶A连接酶包含SidI。
19.权利要求18的重组细胞，其中所述SidI是由多核苷酸所编码，所述多核苷酸分离自
产生包含脱水甲羟戊酰单元的铁载体的微生物。
20.权利要求18的重组细胞，其中所述SidI是由分离自曲霉属成员的多核苷酸所编码。
21.权利要求20的重组细胞，其中所述曲霉属成员包括烟曲霉。
22.权利要求11的重组细胞，其中所述烯酰-辅酶A水合酶包含SidH。
23.权利要求22的重组细胞，其中所述SidH是由多核苷酸所编码，所述多核苷酸分离自
产生包含脱水甲羟戊酰单元的铁载体的微生物。
24.权利要求22的重组细胞，其中所述SidH是由分离自曲霉属成员的多核苷酸所编码。
25.权利要求24的重组细胞，其中所述曲霉属成员包括烟曲霉。
26.权利要求9-25中任一项的重组细胞，其被进一步修饰而表现出相比野生型对照增
加的3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A的生物合成。
27.权利要求26的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的烯酰-辅酶A
还原酶活性。
28.权利要求27的重组细胞，其中所述烯酰-辅酶A还原酶包含Ter。
29.权利要求9-25中任一项的重组细胞，其被进一步修饰而表现出相比野生型对照增
加的积累脱水甲羟戊酸内酯的能力。
30.权利要求9-25中任一项的重组细胞，其被进一步修饰而表现出相比野生型对照的
脱水甲羟戊酸内酯向β-甲基-δ-戊内酯的转化。
31.权利要求30的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的烯醇还原酶
活性。
32.权利要求31的重组细胞，其中所述烯醇还原酶包含OYE2、OYE3、YqjM、或YqjM的变
体。
33.权利要求32的重组细胞，其中所述OYE2或OYE3是由分离自酵母科成员的多核苷酸
所编码。
34.权利要求33的重组细胞，其中所述酵母科成员是酿酒酵母。
35.权利要求32的重组细胞，其中所述YqjM是由分离自芽孢杆菌属成员的多核苷酸所
编码。
36.权利要求32的重组细胞，其中所述芽孢杆菌属成员包括枯草芽孢杆菌。
37.权利要求9-36中任一项的重组细胞，其中所述细胞包含或源自埃希氏菌属成员、沙
雷氏菌属成员、芽孢杆菌属成员、短杆菌属成员、棒杆菌属成员、梭菌属成员、假单胞菌属成
员、假丝酵母属成员、乳球菌属成员、酵母科成员或蓝细菌属成员。
38.权利要求9-37中任一项的重组细胞，其中相比野生型对照，所述重组细胞被修饰以
降低天然甲羟戊酸消耗。
39.权利要求9-38中任一项的重组细胞，其中相比野生型对照，所述重组细胞被修饰以
增加乙酰基-辅酶A流量。
40.权利要求39的重组细胞，其中增加乙酰基-辅酶A流量包括相比野生型对照而言降
低TCA循环活性，相比野生型对照而言增加丙酮酸脱氢酶活性，或相比野生型对照而言缺失
乙酰基-辅酶A消耗酶。
41.权利要求9-40中任一项的重组细胞，其被修饰而表现出相比野生型对照当培养在
包含碳源的培养基中时增加的脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸的生物合成，所述碳源包
含以下的至少一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：张科春，熊明勇，
申请(专利权)人：明尼苏达大学评议会，
类型：发明
国别省市：美国;US