本发明专利技术涉及医药技术领域和生物工程技术领域，具体涉及一种基于聚乙二醇‑聚乳酸羟基乙醇酸‑聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒及其制备与应用。本发明专利技术的复合纳米材料包载的重组质粒为mPPP‑pSNAV2‑TGFβ1‑IRES‑TIMP1(PSTIT)，本发明专利技术还提供PSTIT的制备方法，以及在制备靶向治疗糖尿病足(DF)药物、糖尿病患者因周围神经病变(DPN)药物中的应用。本发明专利技术提出了DPN治疗的新靶点，并通过细胞实验、动物实验，证明本发明专利技术的PSTIT可以通过上调Bcl‑2蛋白，下调Caspase‑3、Bax蛋白的表达有效地减轻糖尿病神经病变大鼠神经细胞的凋亡，延缓DNP的进展。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及医药
和生物工程
，具体涉及一种基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒及其制备与应用。
技术介绍
：糖尿病足(diabeticfoot，DF)，足部是糖尿病这个多系统疾病的一个复杂的靶器官。糖尿病患者因周围神经病变(diabeticneuropathy，DPN)与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形形成，进而引发一系列足部问题，从轻度的神经症状到严重的溃疡、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折。如果积极治疗不能充分解决下肢出现的症状和并发症，则会造成灾难性的后果。临床上，对糖尿病足的治疗主要集中在溃疡的治疗、感染的治疗，以及Charcot关节病的治疗。糖尿病足的预防目前还是通过积极控制血糖从根本上降低糖尿病足的发病风险。近年来研究显示，神经脱髓鞘改变是引发疼痛和感觉减退症状，导致糖尿病足发生的重要原因，但其发病机制尚不清楚(MalikRA.Pathologyofhumandiabeticneuropathy.Handbookofclinicalneurology2014；126:249-59.)。本专利技术人所在的课题组前期研究中发现，DPN患者和糖尿病大鼠坐骨神经均存在显著脱髓鞘病理改变和CD8+T细胞浸润，与既往研究报道相符。在上海市科委基金的资助下，本专利技术人所在的课题组通过质谱技术对DPN患者外周血CD8+T细胞蛋白质表达进行了检测，结合分子生物学方法证实，高糖可激活CD8+T细胞p38MAPK信号通路，诱导趋化因子受体CXCR3显著高表达，同时诱导周围神经组织中神经膜细胞(SCs)趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11表达水平显著升高。进而，通过对体外高糖共培养体系SCs进一步验证，CD8+T细胞可MHCⅠ类限制髓鞘碱性蛋白(MBP)诱导分化为特异性细胞毒性T细胞(CTL)，进而受SCs趋化迁移至周围神经组织，并诱导SCs发生凋亡。研究结果发表在CellPhysiolBiochem及国内核心期刊(TangW,LvQ,ChenXF,ZouJJ,LiuZM,ShiYQ.CD8(+)Tcell-mediatedcytotoxicitytowardSchwanncellspromotesdiabeticperipheralneuropathy.Cellularphysiologyandbiochemistry:internationaljournalofexperimentalcellularphysiology,biochemistry,andpharmacology2013；32(4):827-37.；汤玮,闾倩,梁翠,etal.高糖激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导CD8～+T淋巴细胞表达辅助性T淋巴细胞1型趋化因子受体3.上海医学2013；(5):438-41.)。本专利技术人的前期成果明确了高糖环境下SCs与CD8+T细胞间的相互影响，提出了两者在DPN中致病的作用和机制，对进一步阐明DPN的发病机制和寻找有效的治疗靶点有指导意义。靶向治疗是现在疾病治疗领域的突破性和革命性的发展方向，其中分子靶向是靶向治疗中特异性最高的病因治疗。随着对机体分子生物学的深入了解，DNA重组技术、计算机控制的生产工艺和纯化等技术发展，分子靶向治疗新药研究进程大大加速，并取得了极好的社会与经济效益。新型靶向纳米微泡造影剂以其分子小、穿透力强的突出特性，可穿越血管内皮间隙，到达细胞外基质。大大提高超声对血管外病变的诊断治疗能力，成为近年来研究的热点。研究证明利用聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL，mPPP)阳离子纳米载体进行前列腺癌基因转染，可提高前列腺PC-3细胞转染率；用于视网膜组织基因转染中，可提高体内视网膜组织转染率。三嵌段共聚物mPEG-PLGA-PLL是一种新型纳米载体，它是一种阳离子共聚物，PLL用于增加纳米粒子的正电性，通过静电相互作用有效包裹目的基因，起到保护递送的作用；mPEG增强共聚物的亲水性和组织相容性，提高载体稳定性，起到延长保护作用；载体材料中的PLGA是一种经典的可控缓释材料,通过调节各嵌段比及分子量大小等因素调节降解速度，mPEG-PLGA-PLL材料的生物可降解性降低了载体材料的细胞毒性。目前，mPPP在心血管疾病的应用主要集中在心肌缺血方面。在动脉粥样硬化斑块方面，国内有报道，运用超声造影剂观察和评价易损斑块内的新生血管(熊莉,邓又斌.超声造影评价颈动脉易损斑块内新生血管.中华超声影像学杂志2008；17(4):990-3.)；国外有报道，制备双靶向磷脂微泡，将血管细胞黏附分子-1和P-选择素结合到微泡上，观察微泡在目的基因的显影(JadejaRN,ThouaojamMC,SankhariJM,JainM,DevkarRV,RamachandranAV.Standardizedflavonoid-richEugeniajambolanaseedextractretardsinvitroandinvivoLDLoxidationandexpressionofVCAM-1andP-selectininatherogenicrats.Cardiovasculartoxicology2012；12(1):73-82.)。但用于治疗方面，报道很少。中国专利申请CN201310303193.3公开了一种重组抗高血压肽肠溶纳米粒，是一种载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，用于制备降压药物(公开号为CN103341156A)。目前尚无有关用mPPP复合纳米材料包载重组质粒靶向治疗DNP的文献报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒，本专利技术的另一目的在于提供上述mPPP复合纳米材料包载的重组质粒的制备方法，本专利技术的另一目的在于提供上述mPPP复合纳米材料包载的重组质粒在靶向基因治疗糖尿病足中的应用。本专利技术人所在的课题组拟在前期研究成果的基础上，采用内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysites，IRES)把CXCR3和CXCL9联合构建于rAAV质粒上，再制成包含靶向基因的mPPP纳米材料，进而研究其临床应用前景。本专利技术的技术方案是：将CXCR3(NW_007906068.1)、CXCL9(N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于聚乙二醇‑聚乳酸羟基乙醇酸‑聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒包含IRES基因序列、CXCR3基因序列和CXCL9基因序列。
【技术特征摘要】
1.一种基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重
组质粒，其特征在于，所述的重组质粒包含IRES基因序列、CXCR3基因
序列和CXCL9基因序列。
2.根据权利要求1所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合
纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，所述的载体质粒为rAAV质粒。
3.根据权利要求1或2所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸
复合纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸
-聚赖氨酸复合纳米材料与重组质粒的D/P值为1～15。
4.根据权利要求1或2所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸
复合纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸
-聚赖氨酸复合纳米材料与重组质粒的D/P值为3。
5.如权利要求1所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳
米材料包载的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如
下步骤：
A、pIRES-CXCL9的构建
将含CXCL9的pCXCL9N1质粒用Sal和Not双酶切低熔点胶分离并
回收CXCL9片段，克隆入已行相应酶切Sal、Not...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤玮，石勇铨，刘浩琪，闾倩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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