一种抑制植物基因转录的方法技术

本发明专利技术公开了一种抑制植物基因转录的方法。本发明专利技术提供了一种抑制植物基因转录的方法，包括如下步骤：1)选取靶基因中大于等于15bp的核苷酸序列作为靶序列；2)根据所述靶序列中的每个核苷酸的排列顺序列出识别所述靶序列的串联模块DNA片段序列，制备所述串联模块DNA片段；本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术利用TALE特异性识别DNA碱基的能力，以Unit Assembly的方法为基础进行了TALE载体的构建，在植物中表达的TALE蛋白与靶定DNA特异性结合后，会干扰靶基因的正常转录，从而造成其转录水平降低。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制植物基因转录的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种抑制植物基因转录的方法。
技术介绍
转录激活因子样效应物(transcriptionactivator-likeeffectors,TALEs)最初被发现大量存在于黄单胞菌中，具有识别不同核苷酸的能力。这些效应物能够通过黄单胞菌的III型分泌系统进入植物体内，和宿主基因的某些特异序列结合，从而调节植物自身发病和抗病基因的表达。TALE由N末端的核定位信号、N端区域、中部的DNA结合域以及C端区域构成。TALE结合DNA的特异性依赖于一段可变的34-35个氨基酸串联的重复单元，该单元的第12和13位对识别不同碱基核苷酸起决定作用。HD(即单元的12和13位分别为组氨酸和天冬氨酸)重复单元识别C，NN和NK均识别G，NI和NG分别识别A和T。因此，效应物TALE的这种识别不同碱基核苷酸的能力为基因精细调控提供了新的技术手段。然而，关于TALE的功能及其用途仍有待挖掘。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种抑制植物中靶基因转录的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)选取靶基因中大于等于15bp的核苷酸序列作为靶序列；2)根据所述靶序列中的每个核苷酸的排列顺序列出识别所述靶序列的串联模块DNA片段序列，制备所述串联模块DNA片段；所述串联模块DNA片段由与靶序列中核苷酸数目一致的模块DNA依次连接得到；识别核苷酸A的模块DNA为NI模块DNA，识别核苷酸T的模块DNA为NG模块DNA、识别核苷酸G的模块DNA为HD模块DNA，识别核苷酸C的的模块DNA为NN模块DNA；3)将所述串联模块DNA片段和位于其两端的TALEN末端片段及TALEC末端片段导入目的植物中，实现抑制植物中靶基因转录。上述方法中，步骤3)中，所述串联模块DNA片段和位于其两端的TALEN末端片段及TALEC末端片段通过重组载体导入所述目的植物。上述方法中，所述重组载体为将所述串联模块DNA片段插入含有TALEN末端片段及TALEC末端片段的表达载体中得到的载体，且使所述串联模块DNA片段位于所述TALEN末端片段和TALEC末端片段之间形成TALE片段。上述方法中，所述表达载体为p1300M3载体。上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或所述双子叶植物具体为拟南芥。本专利技术的另一个目的是提供一种抑制植物中靶基因转录的物质。本专利技术提供的物质，为如下1)-3)中任一种：1)串联模块DNA片段；2)含有串联模块DNA片段的TALE片段；3)表达所述1)或2)的重组载体、表达盒、宿主菌或转基因细胞系；所述TALE片段由TALEN末端片段、串联模块DNA片段和TALEC末端片段组成；所述串联模块DNA片段所述串联模块DNA片段由与靶序列中核苷酸数目一致的模块DNA依次连接得到；识别核苷酸A的模块DNA为NI模块DNA，识别核苷酸T的模块DNA为NG模块DNA、识别核苷酸G的模块DNA为HD模块DNA，识别核苷酸C的的模块DNA为NN模块DNA；所述靶序列为所述靶基因中大于等于15bp的核苷酸序列。上述物质中，所述表达1)或2)的重组载体为将所述串联模块DNA片段插入含有TALEN末端片段及TALEC末端片段的表达载体中得到的载体，且使所述串联模块DNA片段位于所述TALEN末端片段和TALEC末端片段之间形成TALE片段。上述物质中，所述表达载体为p1300M3载体。上述的物质在抑制植物中靶基因转录中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述的物质在制备抑制植物中靶基因转录产品中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或所述双子叶植物具体为拟南芥。所述靶序列大小为15-17bp；所述靶基因为拟南芥DET2基因；所述NI模块DNA的核苷酸序列为序列1；所述NG模块DNA的核苷酸序列为序列2；所述HD模块DNA的核苷酸序列为序列3；所述NN模块DNA的核苷酸序列为序列4；所述TALEN末端片段的核苷酸序列为序列5；所述TALEC末端片段的核苷酸序列为序列6。本专利技术的实验证明，本专利技术利用TALE特异性识别DNA碱基的能力，以UnitAssembly的方法为基础进行了TALE载体的构建，在植物中表达的TALE蛋白与靶定DNA特异性结合后，会干扰靶基因的正常转录，从而造成其转录水平降低。该方法操作简单，不需要与FOK1酶融合，也不需要成对作用，只用一个上游或下游的TALE即可；且由于没有FOK1酶抑制目的基因表达不改变基因组；且靶点选择范围广泛，可以在拟南芥和其它多种植物中应用。附图说明图1为p1300M3载体示意图。图2为瞬时转化实验中靶基因DET2的转录抑制效果。图3为稳定转化实验中靶基因DET2的转录抑制效果。图4为拟南芥p1300M3-DET2转基因植株的表型。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。拟南芥Col-0种子可从http://abrc.osu.edu/resources购买。pCAMBIA1300载体可通过http://www.addgene.org网站购买，也可使用其它适合的植物表达载体。p1300M3按照如下方法制备：1)将pCAMBIA1300载体中的NheI酶切识别位点GCTAGC定点突变为GCTCGC，且保持其他序列不变，得到中间载体；2)将由TALE的NC端片段插入中间载体的XbaI和PstI酶切位点间，得到载体p1300M3；TALE的NC端片段由序列5所示的TALE的N端和序列6所示的TALE的C端组成；且序列5的3’末端碱基和序列6的5’末端碱基相邻。UnitAssembly方法所需载体由北京大学生命科学学院张博教授赠予。下述实施例中以抑制AtDET2基因转录为例。实施例1、抑制植物基因转录水平一、拟南芥基因组中AtDET2基因靶序列选择在TAIR网站下载AtDET2的基因信息，选择基因组序列中434-449位碱基作为靶序列，靶序列为CGCCTCTTCCGCAGCT，共17个核苷酸。二、识别靶序列的串联模块DNA片段的制备识别A、T、G、C四个碱基的模块序列依次为NI、NG、HD、NN(序列如表1所示)；表1为4个模块DNA序列根据靶序列中的17个核苷酸的排列顺序，确定识别靶序列的串联模块DNA片段为HDNNHDHDNGHDNGNGHDHDNNHDNINNHDNI；可以人工合成上述识别靶序列的串联模块DNA片段，也可以通过如下方法制备上述识别靶序列的串联模块DNA片段：1)使用内切酶SpeI和HindIII将识别A，T，G，C四个碱基的模块序列NI，NG，HD，NN分别从四个质粒pMD18T-NI，pMD18T-NG，pMD-18T-HD，pMD18T-NN中进行双酶切，分别得到酶切产物NI，NG，HD，NN；同时用NheI和HindIII内切酶对pMD18T-NI，pMD18T-NG，pMD-18T-HD，pMD18T-NN四个质粒进行双酶切，得到线性载体pMD18T-NI，pMD18T-NG，pMD-18T-HD，pMD18T-NN。酶切反应温度为37℃，反应时间为3h。2)将酶切产物NI，NG，HD，NN及线性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制植物中靶基因转录的方法，包括如下步骤：1)选取靶基因中大于等于15bp的核苷酸序列作为靶序列；2)根据所述靶序列中的每个核苷酸的排列顺序列出识别所述靶序列的串联模块DNA片段序列，制备所述串联模块DNA片段；所述串联模块DNA片段由与靶序列中核苷酸数目一致的模块DNA依次连接得到；识别核苷酸A的模块DNA为NI模块DNA，识别核苷酸T的模块DNA为NG模块DNA、识别核苷酸G的模块DNA为HD模块DNA，识别核苷酸C的的模块DNA为NN模块DNA；3)将所述串联模块DNA片段和位于其两端的TALE N末端片段及TALE C末端片段导入目的植物中，实现抑制植物中靶基因转录。

【技术特征摘要】
1.一种抑制拟南芥中靶基因DET2转录的方法，包括如下步骤：1）选取靶基因DET2中大于等于15bp的核苷酸序列作为靶序列；2）根据所述靶序列中的每个核苷酸的排列顺序列出识别所述靶序列的串联模块DNA片段序列，制备所述串联模块DNA片段；所述串联模块DNA片段由与靶序列中核苷酸数目一致的模块DNA依次连接得到；识别核苷酸A的模块DNA为NI模块DNA，识别核苷酸T的模块DNA为NG模块DNA、识别核苷酸G的模块DNA为HD模块DNA，识别核苷酸C的模块DNA为NN模块DNA；3）将所述串联模块DNA片段和位于其两端的TALEN末端片段及TALEC末端片段导入目的植物中，实现抑制植物中靶基因转录；所述NI模块DNA的核苷酸序列为序列1；所述NG模块DNA的核苷酸序列为序列2；所述HD模块DNA的核苷酸序列为序列3；所述NN模块DNA的核苷酸序列为序列4；所述TALEN末端片段的核苷酸序列为序列5；所述TALEC末端片段的核苷酸序列为序列6。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，所述串联模块DNA片段和位于其两端的TALEN末端片段及TALEC末端片段通过重组载体导入所述目的植物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组载体为将所述串联模块DNA片段插入含有TALEN末端片段及TALEC末端片段的表达载体中得到的载体，且使所述串联模块DNA片段位于所述TALEN末端片段和TALEC末端片段之间形成TALE片段。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，林森，赵媛媛，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11