一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法与装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，包括光源以及沿光路依次布置的：线偏光发生模块，用于将光源发出的光束转换为线偏光；自由曲面聚焦模块，用于将所述的线偏光转换为环状聚焦光；数字微镜反射模块，用于选择区域反射所述的环状聚焦光；光学放大传递模块，用于实现光束的全内反射照明；荧光成像模块，用于激发样品发出荧光并收集荧光信号图像。本发明专利技术还公开了一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法，本发明专利技术无机械振动模块，扫描更稳定，噪声更小；激光能量利用率更高，成像视场更加均匀；DMD控制控制扫描，角度更加准确，利于实现分层扫描与3D图像重建。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及显微成像领域，尤其涉及一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法与装置。
技术介绍
随着生物科学研究的发展，特别是与膜相关的生物现象的研究，对于一种仅观察单层样品结构的显微方法有着强烈的需求。传统的显微方法中，照明时整个视场在z轴方向上都被照明光束照明，z轴方向的分辨率和信噪比一直都做不高，为此光切片显微镜和全内反射显微镜(Tirf)都是提高z轴分辨率的技术手段。光切片显微镜采用横向照明的方法，但由于衍射极限的存在，横向照明的最细光束只能做到半波长量级，其z轴分辨率依然达不到仅观察细胞膜结构的要求，而且由于细胞的贴壁生长，光切片显微技术很难准确照明到相应的位置。全内反射显微镜(Tirf)是一种利用全内反射原理，由于倏逝场沿z轴方向的衰减特性，通过改变全内反射的入射角度可以实现不同的衰减系数，从而可以在细胞与装载波片之间形成100nm厚的光场，这层光场恰好与细胞的贴壁生长时细胞膜的位置重合，实现了细胞膜的准确照明。但是由于激光散斑的存在会导致光场不均匀。为此一种旋转全内反射显微系统(Ring-tirf)的专利技术用过旋转的方法均匀了照明光场，现在的实现旋转的方法有两种方法，如专利申请号为CN103597396A提出的振镜法和数字微镜(DMD)，但这两种方法都有自身存在的缺陷，振镜法无法避免角度震动，而数字微镜的方法会导致光能量的利用率比较低，只有5％左右。
技术实现思路
为克服现有技术中存在的不足，提高Tirf显微方法的照明均匀性和稳定性，提高激光的利用率至85％，同时使系统更加容易稳定控制，本专利技术提供了一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法与装置，利用自由曲面透镜和数字微镜实现均匀的全内反射显微照明。本专利技术的具体技术方案如下：一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法，包括以下步骤：1)激光经由光纤导入系统，通过准直透镜成为平行光束，得到的平行光束透过偏振片和二分之一波片，形成线偏光，旋转二分之一波片可以改变偏振方向；2)线偏光透过自由曲面透镜，自由曲面透镜能够使光聚焦成一个环；3)透过自有曲面的光束照射到一偏振分光棱镜(PBS)，由于光束偏振方向可调，能够实现在PBS上全部反射；4)经过PBS反射的光透过四分之一波片，四分之一波片快轴与光束偏振方向夹角45°，透过四分之一波片的光束聚焦到数字微镜(DMD)上，其中DMD处于自由曲面透镜的焦点处，被DMD反射的光再次透过四分之一波片照射到PBS上，由于四分之一波片的偏振矫正，光束能够完全透射PBS，透过PBS的光再通过四分之一波片变成圆偏光；5)透过PBS的光透过变焦准直透镜，再透过二色镜照射到场镜上，所述DMD面位于准直透镜的后焦面上，准直透镜与场镜构成4f系统，经过场镜的光束聚焦在全反射物镜的后焦面上，全反射物镜与场镜构成4f系统，样品与样品容器的接触层(即全反射面)位于全反射物镜的前焦面上；6)样品在激光的照射下发出荧光，荧光透过显微物镜和场镜照射到二色镜上，荧光被二色镜反射照射，再经过滤光片在成像系统(CCD)上成像；本专利技术中，显微系统操作时，由于自由曲面透镜的作用，激光光束可以在DMD上聚焦成一“O”型纤细的环状光斑，通过控制DMD使一个“C”形区域的光能够反射到变焦准直透镜内，“C”形反射区域能够旋转，“C”形反射区域旋转一周的时间，CCD拍一张照片，得到的照片即为高均匀性、低能量损耗的全内反射图像。本专利技术中，变焦准直透镜能够改变焦距，从而改变“C”形反射区域在全反射透镜后焦面上的投影大小，从而改变全反射角度的大小，进而改变投射深度，能够根据不同的样品调整照明深度，实现样品的选择照明以及图像的三维重构。本专利技术还提供了一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，包括沿光路依次布置的：线偏光发生模块，包括传导激光光束的光纤和准直透镜以及偏振片和二分之一波片，偏振片用于产生线偏光，二分之一波片用于改变偏振方向；自由曲面光束聚焦模块，用于产生环状聚焦光的环状曲面透镜；DMD数字扫描模块，包括沿光路设置的PBS、四分之一波片和DMD，经过自由曲面光束聚焦模块的线偏光会在PBS处全部反射，经过四分之一波片后变为圆偏光聚焦在DMD上，被DMD反射的光再一次通过四分之一波片，再次变成线偏光，线偏光穿过PBS，通过PBS的光再通过四分之一波片成为圆偏光；光学放大传递模块，包括一焦距可调的准直透镜组和显微场镜，能够将DMD上的扫描形状，成像到Tirf显微物镜的后焦面上；荧光成像模块，包括显微物镜、场镜、二色镜和CCD。本专利技术的工作原理如下：本专利技术的原理为利用夫琅禾费衍射定理，光衍射斑的互补原理，在传统的全反射显微镜中是用单个角度进行全反射透明，在本专利技术中是用一个有缺口的光环聚焦在显微物镜的后焦面上，当带缺口光环旋转时能够实现类似环状扫描全内反射显微镜相同的效果。具体实施过程中工作原理如下：偏振光生成模块由光纤、准直透镜、偏振片、二分之一波片组成，偏振片的琼斯矩阵为θ为偏振片与x轴夹角，二分之一波片的琼斯矩阵为为二分之一波片快轴与x轴夹角，因此可以通过改变二分之一波片的角度来改变光的偏振方向；自由曲面聚焦模块，自由曲面设计为中心对称的环状聚焦透镜，以自由曲面为极轴建立极坐标系，其设计面型参数f(r,θ)满足r,θ分别为描述自由曲面形状的极坐标系参数，面型上点到极点的距离a,b为曲率调节系数，改变他们的值能够调整自由曲面聚焦的焦距；r0,z0为径向调节系数，用来改变自由曲面尺寸，调整在数字微镜反射面上聚焦光环的尺寸。数字微镜反射模块，该模块由PBS、两块四分之一波片和DMD组成，PBS具有偏振选择性，从自由曲面聚焦模块出来的光再PBS处全部反射，反射光通过四分之一波片，再打到DMD上发生反射，DMD跟电脑相连，通过编程可以改变反射光的形状，反射光再次通过四分之一波片，再通过PBS，透射PBS的光再经过第二片四分之一波片。四分之一波片的琼斯矩阵为光两次通过第一片四分之一波片，光偏振方向变垂直，保证DMD反射的光能够在PBS处透射，透过PBS的光经过第二片四分之一波片，使光成为圆偏光。光学放大传递模块，该模块由一可变焦距的透镜和显微场镜组成，设可变焦距透镜的焦距为f变，场镜焦距为f场，根据成像原理本模块能把DMD上的光斑像成像到全反射显微物镜的后焦面上，成像大小比为f场/f变，通过改变f变的大小，即可调整入射角度的大小，实现不同角度的全内反射照明。荧光成像模块，包括全反射显微物镜、场镜、二色镜、滤光片和CCD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，其特征在于，包括光源以及沿光路依次布置的：线偏光发生模块，用于将光源发出的光束转换为线偏光；自由曲面聚焦模块，用于将所述的线偏光转换为环状聚焦光；数字微镜反射模块，用于选择区域反射所述的环状聚焦光；光学放大传递模块，用于实现光束的全内反射照明；荧光成像模块，用于激发样品发出荧光并收集荧光信号图像。

【技术特征摘要】
1.一种基于自由曲面整形的全内反射显微装置，其特征在于，包括光源以及沿光路依
次布置的：
线偏光发生模块，用于将光源发出的光束转换为线偏光；
自由曲面聚焦模块，用于将所述的线偏光转换为环状聚焦光；
数字微镜反射模块，用于选择区域反射所述的环状聚焦光；
光学放大传递模块，用于实现光束的全内反射照明；
荧光成像模块，用于激发样品发出荧光并收集荧光信号图像。
2.如权利要求1所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述的线偏光发生模块包括用
于产生线偏光的偏振片和用于改变偏振方向的二分之一波片。
3.如权利要求1所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述自由曲面聚焦模块为自由
曲面呈中心对称分布的环状聚焦透镜。
4.如权利要求3所述的全内反射显微装置，其特征在于，所述自由曲面的其设计面型参
数满足：
( r c o s θ - r 0 c o s θ ) 2 a 2 + ( r s i n θ - r 0 s i n θ ) 2 b 2 = 1 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，修鹏，刘旭，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33