三萜2位α-羟化酶MAA45及其相关生物材料与它们在制备山楂酸和科罗索酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了三萜2位α‑羟化酶MAA45及其相关生物材料与它们在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。本发明专利技术公开的三萜2位α‑羟化酶MAA45是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，MAA45可以以齐墩果酸为底物制备山楂酸，还可以以乌索酸为底物制备科罗索酸，可以利用MAA45及其编码基因制备山楂酸和科罗索酸，还可以利用MAA45催化三萜2位α‑羟化。

【技术实现步骤摘要】
三萜2位α-羟化酶MAA45及其相关生物材料与它们在制备山楂酸和科罗索酸中的应用
本专利技术涉及生物
中三萜2位α-羟化酶MAA45及其相关生物材料与它们在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。
技术介绍
山楂酸(Maslinicacid)(式1)、科罗索酸(Corosolicacid)(式2)和积雪草酸(Asiaticacid)(式3)等为代表的2位α-羟化药用三萜类活性成分均是山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)，枇杷(Eriobotryajaponica)，大花紫薇(Lagerstroemiaspeciosa(L.)Pers.)和积雪草(Centellaasiatica(L.)Urb.)等药用植物自身合成的微量次生代谢物，山楂酸与科罗索酸均为五环三萜酸，分属于β-香树脂型或α-香树脂型五环三萜类化合物，山楂酸与科罗索酸为同分异构体，在植物体内，二者常常共同存在。山楂酸、科罗索酸和积雪草酸在抗癌，抗艾滋病毒，美容及肝脏保护等领域有广泛应用，已作为营养补充剂或化妆品在市场上流通。目前这类化合物主要是从山楂，大花紫薇、枇杷等植物中分离提取得到，但这种方法有较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(ParayilKumaranAjikumaretal.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量(EffendiLeonardetal.,2010,PNAS,107(31):13654–13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinicacid)最高达到25g/L(PaddonCJetal.,2013,Nature,2013,496:528-532)；目前国内在青蒿素，紫杉醇，人参皂苷和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究。然而，清晰的天然药物生物合成过程是应用合成生物学技术创建人工细胞工厂发酵生产目标化合物的前提。目前在三萜化合物的生物合成途径研究方面已有相关进展，包括形成各三萜基本骨架的环合酶和在基本骨架上进行6-，11-，16-，22-，23-，24-，28-氧化的P450酶，但在2位发生α-羟化的酶(一种P450酶)还未挖掘。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何制备山楂酸和/或科罗索酸。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种具有羟化酶功能的蛋白质，其名称为山楂酸/科罗索酸相关蛋白(MAA45)，MAA45是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。其中，序列1由476个氨基酸残基组成。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A2)中的MAA45蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述A2)中的MAA45蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的MAA45蛋白质的编码基因可通过将序列2的第795-2225位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了与MAA45相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：B1)编码MAA45的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：1)编码序列是序列表中序列2的第795-2225位的cDNA分子或DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码MAA45的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码MAA45的cDNA分子或基因组DNA分子；B2)所述表达盒可为序列表中序列2的第7-2450位所示的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列2的第1-6位与第2541-2546位均为SacII的识别序列，序列2的第7-787位为PGK1启动子的序列，序列2的第788-794位为SexA的识别序列，序列2的第795-2225位为MAA45基因的序列，编码序列1所示的MAA45，序列2的第2226-2233位为AscI的识别序列，序列2的第2234-2540位为CYC1t终止子的序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码MAA45的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的MAA45的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码MAA45且具有MAA45功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有编码MAA45的核酸分子的表达盒(MAA45基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质，是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，是氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1）至B4）中的任一种：B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；B2）含有B1）所述核酸分子的重组载体；B3）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；B4）含有B2）所述重组载体的重组微生物。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为编码序列是序列表中序列2的第795-2225位的cDNA分子。4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：所述重组微生物为将B1）所述核酸分子导入酿酒酵母Saccharomycescerevisiae得到的表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物。5.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括：培养含有权利要求1所述蛋白质的编码基因的重组载体的重组微生物，使权利要求1所述蛋白质的编码基因表达，得到表达所述蛋白质的重组微生物培养物；从所述重组微生物培养物中得到所述蛋白质。6.山楂酸和/或科罗索酸的制备方法，包括以齐墩果酸和/或乌索酸为底物用权利要求1所述的蛋白质进行催化反应得到山楂酸和/或科罗索酸。7.山楂酸和/或科罗索酸的制备方法，包括：将含有权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，戴住波，刘芸，王冬，张丽丽，李守连，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12