一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法，首先在电极表面通过电聚合法形成含巯基的聚邻氨基苯硫酚膜，再通过恒电位沉积法使金离子在电极表面电还原形成纳米金，并通过电聚合膜上的巯基使纳米金锚定在该电极表面，然后将载脂蛋白apoB‑100抗体固定在纳米金上，利用apoB‑100抗体对低密度脂蛋白的特异性识别作用，将低密度脂蛋白捕获至电极表面。在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶两种酶的协同作用下，低密度脂蛋白中的胆固醇发生分解并产生一种弱还原剂H2O2，该还原剂可以使银离子在金纳米颗粒表面发生还原并沉积到金纳米颗粒表面。最后根据检测银单质的溶出伏安电流值，绘制标准曲线，实现对低密度脂蛋白胆固醇的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，涉及一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法。
技术介绍
低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoproteincholesterol，LDL-C)，是动脉粥样硬化斑块的主要成分，是导致动脉粥样硬化性血管疾病的罪魁。临床研究证实，LDL-C升高与动脉粥样硬化、冠心病的发病率之间呈正相关性。因此，准确测定血清中LDL-C的含量，对于动脉粥样硬化、高血压、冠心病等疾病诊断、预防和治疗有重要意义。检测方法主要有超速离心法、电泳法、化学或免疫沉淀法等，而目前临床实验室采用的沉淀法，血清中甘油三酯的含量对其检测有较大的干扰。最近，JohnJ等报道了一种均相法检测LDL-C，其检测敏感性和特异性有了很大的提高(JohnJ,Albers,HalKennedy,SanticaM,Marcovina.EvaluationofanewhomogenousmethodfordetectionofsmalldenseLDLcholesterol:ComparisonwiththeLDLcholesterolprofileobtainedbydensitygradientultracetrifugation[J].ClinicaChimicaActa.412.556-561(2011))；而渡边基一等利用下述三种试剂或试剂组中的任何一种：(1)硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚试剂组；(2)两性表面活性剂和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺试剂组；(3)聚阳离子试剂。与氧化还原酶一起构建了一种胆固醇传感器和胆固醇的定量方法(渡边基一，汤川系子，南海史郎.胆固醇传感器和胆固醇的定量方法.中国，专利技术专利，授权时间：2005.02.02，授权专利号：00802824.9)。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求高，需要建立一种快速、灵敏、操作简便的LDL-C检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法，解决了传统LDL-C检测方法费用昂贵、操作复杂、费时且技术要求高的问题。本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：步骤1：玻碳电极预处理；(1)用Al2O3悬浊液将玻碳电极表面打磨抛光至镜面，抛光后的电极依次在纯水、无水乙醇、纯水中磁力搅拌洗涤；(2)将电极置于piraha溶液中浸泡，用纯水冲洗干净后再在纯水中磁力搅拌洗涤；(3)将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的玻碳电极，用纯水冲洗干净；步骤2：电极的修饰；(1)将活化后的玻碳电极浸入含邻氨基苯硫酚和高氯酸溶液中进行循环伏安扫描，扫描完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤；(2)将电极放入HCl、KCl、HAuCl4组成的沉积底液中进行恒电位沉积，沉积完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤，得到修饰了金纳米粒的玻碳电极。步骤3：生物传感界面的构建(1)将apoB-100抗体滴加至修饰了金纳米粒的玻碳电极表面，孵育0.5-2小时，孵育完成后用用纯水将未固定的抗体洗去，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(2)在电极表面滴加BSA溶液封闭反应0.5-2小时；(3)用含BSA的甘氨酸-NaOH缓冲液溶液进行磁力搅拌洗涤；步骤4：LDL-C的标准曲线绘制(1)在步骤3得到的固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加LDL溶液进行孵育，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤将未被捕获的LDL洗去；(2)在电极表面滴加胆固醇酯酶(CHER)、胆固醇氧化酶(CHOD)和AgNO3的溶液，避光孵育得到沉积有单质银的工作电极，该电极用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(3)将电极放入KNO3溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰；(4)根据单质银的溶出伏安电流值大小，绘制LDL-C标准曲线，计算灵敏度和检测限。步骤5：待测样品的检测(1)在步骤3得到的固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加15μL待测样品进行孵育，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(2)在电极表面滴加含有CHER酶、CHOD酶和AgNO3的溶液，避光孵育得到沉积有单质银的工作电极，该电极用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(3)将工作电极放入KNO3溶液中，进行线性扫描，扫描范围0.0～+0.8V，扫描速率为50-200mV/s，记录Ag的溶出伏安电流值；(4)根据步骤4所述标准曲线，得到所述待测样品溶液中LDL-C的浓度。进一步，所述步骤1中Al2O3悬浊液颗粒大小为0.3μm和0.05μm。进一步，所述步骤1中piraha溶液为体积比3:7的30％H2O2和98％H2SO4混合配置。进一步，所述步骤1中将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描后，用纯水冲洗干净后，再将电极置于铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中分别进行循环伏安扫描和交流阻抗扫描，最后用纯水冲洗晾干备用。进一步，所述步骤2中，邻氨基苯硫酚浓度为5mmol/L，高氯酸浓度为1mol/L。进一步，所述步骤2中沉积底液分别由同体积的0.01mol/LHCl、0.1mol/LKCl、10μmol/LHAuCl4组成。进一步，所述孵育温度为37℃。进一步，所述甘氨酸-NaOH为pH8.6的甘氨酸0.1mol/L-NaOH缓冲液。进一步，所述步骤4和步骤5中的线性扫描范围0.0～+0.8V，扫描速率为50-200mV/s。其中，步骤1为步骤2提供一个新鲜的电极表面，为形成完整、稳定、牢固、导电性好的高分子聚合膜提供条件。步骤2中高分子聚合膜的形成为步骤3中生物识别分子apoB-100抗体的固定提供位点，从而构成特异性识别LDL的生物传感界面，并有利于电子的传递。步骤3中生物传感界面的构建为步骤4中LDL-C的电化学检测中必不可少的关键步骤。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用双酶协同催化银沉积反应实现电化学检测LDL-C。本专利技术建立的检测LDL-C方法有益效果在于操作简单、检测时间短，易于微型化。附图说明图1基于双酶协同催化银沉积反应原理检测LDL-C的电化学方法原理图；图2电极表面不同修饰过程的循环伏安表征图；图3电极表面不同修饰过程的交流阻抗表征图；图4(a)传感器在不同浓度LDL-C下的响应电流；图4(b)传感器的工作曲线。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：玻碳电极预处理；(1)用Al2O3悬浊液将玻碳电极表面打磨抛光至镜面，抛光后的电极依次在纯水、无水乙醇、纯水中磁力搅拌洗涤；(2)将电极置于piraha溶液中浸泡，用纯水冲洗干净后再在纯水中磁力搅拌洗涤；(3)将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的玻碳电极，用纯水冲洗干净；步骤2：电极的修饰；(1)将活化后的玻碳电极浸入含邻氨基苯硫酚和高氯酸溶液中进行循环伏安扫描，扫描完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤；(2)将电极放入HCl、KCl、HAuCl4组成的沉积底液中进行恒电位沉积，沉积完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤，得到修饰了金纳米粒的玻碳电极。步骤3：生物传感界面的构建(1)将apoB‑100抗体滴加至修饰了金纳米粒的玻碳电极表面，孵育0.5‑2小时，孵育完成后用用纯水将未固定的抗体洗去，用甘氨酸‑NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(2)在电极表面滴加BSA溶液封闭反应0.5‑2小时；(3)用含BSA的甘氨酸‑NaOH缓冲液溶液进行磁力搅拌洗涤；步骤4：LDL‑C的标准曲线绘制(1)在步骤3得到的固定了ApoB‑100抗体的电极表面滴加LDL溶液进行孵育，用甘氨酸‑NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤将未被捕获的LDL洗去；(2)在电极表面滴加胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和AgNO3的溶液，避光孵育得到沉积有单质银的工作电极，该电极用甘氨酸‑NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(3)将电极放入KNO3溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰；(4)根据单质银的溶出伏安电流值大小，绘制LDL‑C标准曲线，计算灵敏度和检测限。步骤5：待测样品的检测(1)在步骤3得到的固定了ApoB‑100抗体的电极表面滴加15μL待测样品进行孵育，用甘氨酸‑NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(2)在电极表面滴加含有CHER酶、CHOD酶和AgNO3的溶液，避光孵育得到沉积有单质银的工作电极，该电极用甘氨酸‑NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；(3)将工作电极放入KNO3溶液中，进行线性扫描，扫描范围0.0～+0.8V，扫描速率为50‑200mV/s，记录Ag的溶出伏安电流值；(4)根据步骤4所述标准曲线，得到所述待测样品溶液中LDL‑C的浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于按
照以下步骤进行：
步骤1：玻碳电极预处理；
(1)用Al2O3悬浊液将玻碳电极表面打磨抛光至镜面，抛光后的电极依次
在纯水、无水乙醇、纯水中磁力搅拌洗涤；
(2)将电极置于piraha溶液中浸泡，用纯水冲洗干净后再在纯水中磁力搅
拌洗涤；
(3)将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的
玻碳电极，用纯水冲洗干净；
步骤2：电极的修饰；
(1)将活化后的玻碳电极浸入含邻氨基苯硫酚和高氯酸溶液中进行循环伏
安扫描，扫描完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤；
(2)将电极放入HCl、KCl、HAuCl4组成的沉积底液中进行恒电位沉积，
沉积完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤，得到修饰了金纳米粒的玻碳电极。
步骤3：生物传感界面的构建
(1)将apoB-100抗体滴加至修饰了金纳米粒的玻碳电极表面，孵育0.5-2
小时，孵育完成后用用纯水将未固定的抗体洗去，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行
磁力搅拌洗涤；
(2)在电极表面滴加BSA溶液封闭反应0.5-2小时；
(3)用含BSA的甘氨酸-NaOH缓冲液溶液进行磁力搅拌洗涤；
步骤4：LDL-C的标准曲线绘制
(1)在步骤3得到的固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加LDL溶液进行
孵育，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤将未被捕获的LDL洗去；
(2)在电极表面滴加胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和AgNO3的溶液，避光孵
育得到沉积有单质银的工作电极，该电极用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌
洗涤；
(3)将电极放入KNO3溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰；
(4)根据单质银的溶出伏安电流值大小，绘制LDL-C标准曲线，计算灵敏

\t度和检测限。
步骤5：待测样品的检测
(1)在步骤3得到的固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加15μL待测样
品进行孵育，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；
(2)在电极表面滴加含有CHER酶、CHOD酶和AgNO3的溶液，避光...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇，崔丽杰，李桂银，梁晋涛，黄国银，周治德，白智昊，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：广西;45