杀虫晶体蛋白、核酸、杀虫晶体蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及杀虫晶体蛋白领域，特别涉及对甜菜夜蛾、水稻二化螟、亚洲玉米螟和小菜蛾有杀虫活性的Cry2类杀虫晶体蛋白。

【技术实现步骤摘要】
杀虫晶体蛋白、核酸、杀虫晶体蛋白的制备方法及其应用
本专利技术涉及杀虫晶体蛋白领域，特别涉及对鳞翅目有杀虫活性的Cry2类杀虫晶体蛋白。
技术介绍
到目前为止，已经发现了约600种的杀虫晶体蛋白，这些杀虫晶体蛋白主要来源于苏云金芽孢杆(Bacillusthuringiensis)。其对9个目500多种昆虫以及线虫、螨类和多种原生动物具有杀虫活性。由于Bt杀虫活性广泛并且与化学农药相比专一性高、安全性好、防治效果好、不污染环境等优点，已经成为目前世界上研究最多，应用最广、最成功的昆虫病原微生物，Bt杀虫剂占生物农药的70％以上，并已经应用于转基因植物，为人类带来很好的经济和生态效益，对其研究还在不断扩展和深入。但是杀虫晶体蛋白的专一性强的特点是一把双刃剑。一方面其专一性强，意味着其对除目标害虫以外的生物，特别是人畜安全；但是另一方面也使得其杀虫谱过窄，对于多种害虫的综合防治来说，需要开发出针对不同害虫有效的杀虫晶体蛋白才能达到防治的目的。然而，现有技术中仅发现苏云金芽孢杆菌的营养期杀虫蛋白(Vip蛋白，一种不同于杀虫晶体蛋白的蛋白)对甜菜夜蛾有较好的活性，而在杀虫晶体蛋白中至今还未发现能够对甜菜夜蛾等具有较好活性的蛋白。因此，有必要从已知或新分离的苏云金芽孢杆菌菌株中寻找能够对甜菜夜蛾等有较好的活性杀虫晶体蛋白。
技术实现思路
本专利技术之一提供了一种杀虫晶体蛋白，其为Cry2类蛋白，所述Cry2类蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。其中，由于氨基酸序列与杀虫活性之间并不是简单的一一对应关系，有的氨基酸序列高度同源但杀虫活性却有很大的不同。随着新基因的不断发现，一种基因具有两种或多种活性的情况不断被发现，为了避免杀虫谱和氨基酸序列的不一致性，Crickmore等提出了一种根据氨基酸序列同源性进行分类，形成了一个开放式分类系统，共分为四级，杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性小于45％为第一等级；在45％-78％之间为第二等级；在78％-95％之间为第三等级；同源性在95％以上为第四等级。其中第一、第四等级用阿拉伯数表示；第二、第三等级分别用大、小写英文字母表示。只要是来自Bt的伴胞晶体蛋白(又称为杀虫晶体蛋白)，对目标生物具有毒性，或与已知的Cry或Cyt蛋白具有很高同源性，就可以纳入这一分类系统。按照Crickmore等提出的基因分类系统，Cry蛋白约70类，本专利技术的Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1之间的同源性在45％-78％之间。现有研究证实，杀虫晶体蛋白原毒素大小约130kDa，但其在130kDa大小的状态下并没有杀虫活性，而是必须经过蛋白酶等作用的切割，切割得到约52-68kDa的蛋白后才能够发挥其活性。其中，所述的切割可以一般发生在有害生物的肠道之内，但也可以人为地有目的地改造为具有相同功能的52-68kDa的蛋白。因此，在一个具体实施例中，所述杀虫晶体蛋白为利用胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种之后获得的52-68kDa的蛋白；优选所述杀虫晶体蛋白为利用胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种之后获得的55-65kDa的蛋白；特别优选所述52-68kDa的蛋白或所述55-65kDa的蛋白与Cry2类蛋白具有相同的功能。在此所述的Cry2类蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。其中，例如与杀虫蛋白Cry2Aa9、Cry2Ab4或Cry2Ah1的相同的功能可以为在防治甜菜夜蛾和/或水稻二化螟中的应用；与杀虫蛋白Cry2Aa17、Cry2Ab29、或Cry2Ba2的相同的功能可以为在防治甜菜夜蛾、亚洲玉米螟和小菜蛾中的应用。在一个具体实施例中，所述杀虫晶体蛋白为所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸的与所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种具有相同功能的蛋白；优选所述杀虫晶体蛋白为mCry2Aa17，所述mCry2Aa17的氨基酸序列为经如SEQIDNo.14所示核酸序列翻译后得到的氨基酸序列。本专利技术之二提供了一种能够翻译为如上的本专利技术所述的杀虫晶体蛋白的核酸。在一个具体实施例中，能够翻译为所述Cry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.8所示，能够翻译为所述Cry2Ab29的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.9所示，能够翻译为所述Cry2Ba2的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.10所示，能够翻译为所述Cry2Aa9的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.11所示，能够翻译为所述Cry2Ab4的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.12所示，和能够翻译为所述Cry2Ah1的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.13所示，能够翻译为所述mCry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.14所示。这些基因的序列可以从Bt菌株中克隆出来，也可以人工合成。本专利技术之三提供了一种制备如上的本专利技术所述的杀虫晶体蛋白的方法，其包括如下步骤：在活体生物中表达上述杀虫晶体蛋白；优选在含有如上的本专利技术所述的核酸序列的活体生物中表达所述杀虫晶体蛋白。本专利技术之四提供了一种制备杀虫晶体蛋白的方法，其包括如下步骤：在16-20℃下表达杀虫晶体蛋白。在一个具体实施例中，所述杀虫晶体蛋白为Cry1-70类蛋白中的至少一种，例如表1中的蛋白中的至少一种；优选为Cry1类蛋白、Cry2类蛋白、Cry3类蛋白和Cry8类蛋白中的至少一种，更优选的为在含有能够翻译为如上的本专利技术所述的杀虫晶体蛋白的核酸，或更具体的讲在含有SEQIDNo.8、如SEQIDNo.9所示、如SEQIDNo.10所示、如SEQIDNo.11所示、如SEQIDNo.12、如SEQIDNo.13所示和如SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杀虫晶体蛋白，其为Cry2类蛋白，所述Cry2类蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种杀虫晶体蛋白，其为Cry2类蛋白，所述Cry2类蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、mCry2Aa17、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，所述mCry2Aa17的氨基酸序列为经如SEQIDNo.14所示核酸序列翻译后得到的氨基酸序列。2.一种能够翻译为如权利要求1所述的杀虫晶体蛋白的核酸。3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，能够翻译为所述Cry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.8所示，能够翻译为所述Cry2Ab29的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.9所示，能够翻译为所述Cry2Ab4的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.12所示，和能够翻译为所述Cry2Ah1的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.13所示，能够翻译为所述mCry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.14所示。4.根据权利要求1所述的杀虫晶体蛋白在防治有害生物中的应用，其中，Cry2Aa17对甜菜夜蛾、亚洲玉米螟和小菜蛾中的一种有活性；mCry2Aa17对甜菜夜蛾、亚洲玉米螟和小菜蛾中的一种有活性；Cry2Ab...

【专利技术属性】
技术研发人员：束长龙，张杰，张风娇，彭琦，宋福平，耿丽丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11