猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种猪圆环病毒优势抗原表位肽建立快速检测层析试纸条及制备方法，可用于快速检测猪血液或血清中的抗体。试纸条包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层。金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的重组G蛋白，检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG。本发明专利技术的试纸条操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、工艺简单可大量制备，成本低廉，适合基层大批量现场检测并可用于猪群PCV2感染的早期快速诊断。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法
本专利技术涉及一种兽医生物
，具体地说是猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及其制备方法，重点用于猪圆环病的抗体监测。
技术介绍
猪圆环病毒(PCV)有2个血清型：PCV1和PCV2，其中PCV1对猪的致病性较低，广泛存在于正常猪群和猪源细胞中；而PCV2对猪的危害性极大，能引起多种疾病综合征，如猪断奶后多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征、繁殖障碍等。此外，该病能对养猪业产生多系统、多阶段、全方位的危害，造成直接或间接的损失。为了更好的控制猪圆环病，就必须及时了解并掌握猪场PCV2(猪圆环病毒2型)的感染情况，而且，新型疫苗的效力检测，也需要简单快速的测定方法作为配套检测技术。目前，常见的PCV2抗体检测方法有间接免疫荧光(IIF)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。ELISA包括竞争ELISA、间接ELISA、抗原捕获ELISA等。IIF和IPMA较为经典，但对操作要求很高，不便于大量样品检测，ELISA操作简单可靠，特异性好，但需要借助昂贵的仪器。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，也是T细胞受体/B细胞受体和抗体特异结合的基本单位，在抗原中起着关键性作用。在机体的免疫系统中，免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质分子，仅识别抗原分子上的抗原决定簇，也就是说抗体的特异性是针对抗原表位而不是针对完整的抗原分子的。抗原表位是免疫原抗原性的物质基础，抗原表位的研究对病原的诊断具有重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及其制备方法，实现快速有效地对猪群PCV2血清抗体进行检测。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条，包括支撑层、加样层、检测层和吸收层；还包括金标蛋白释放垫，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的重组蛋白G；所述检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；所述优势抗原表位肽序列为ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段。上述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法包括如下步骤：S1制备所述优势抗原表位肽；S2制备ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；S3胶体金颗粒的制备，并采用胶体金标记重组蛋白G并用玻璃膜吸附，得到金标蛋白释放垫；S4制备检测层，步骤S1制备得到的优势抗原表位肽和步骤S2制备得到的ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG分别用硝酸纤维膜包被并分别得到检测带和质控带，构成检测层；S5将加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层设于支撑层上。需要说明的是，所述步骤S1的方法具体为：1.1)根据ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段，设计并合成1对引物：ORF2-EF：5’-GCGGATCCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCT-3’ORF2-ER：5’-GCCTCGAGTTAGCGGGAGGAGTAGTTTACA-3’；引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；1.2)以ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段为模板，利用步骤1.1)设计得到的引物对进行PCR处理；1.3)将ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段在pGEX-4T-1中进行克隆，得到的阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C；1.4)将步骤1.3)得到的重组质粒pGEX-ORF2-C转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达，将表达后的蛋白命名为GST-ORF2-C；1.5)谷胱甘肽亲和层析柱层析法纯化GST-ORF2-C，即得优势抗原表位肽。进一步需要说明的是，步骤1.2)中，PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。进一步需要说明的是，步骤1.3)具体方法为：DNA快速连接酶连接，连接体系为：10×ligasebuffer1μl，酶切纯化的目的基因片段5μl，载体pGEX-4T-11μl，T4DNA快速连接酶1μl，双蒸水补足10μl，室温连接15min；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺LB平板于37℃培养过夜，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，并测序正确，阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C。进一步需要说明的是，步骤1.4)中，诱导表达的条件为：在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm培养携带重组质粒pGEX-ORF2-C的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，直至菌液的OD600值介于0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续培养3小时，离心收集细菌沉淀；用pH7.4的PBS洗涤，用80μlPBS悬浮菌体，与20μl的5×SDS裂解缓冲液混合，煮沸变性5分钟；利用蛋白质电泳装置进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离胶的丙烯酰胺浓度为10％，将只含载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株同样诱导做阴性对照，0.25％考马斯亮兰染色；最终得到GST-ORF2-C，即优势抗原表位肽。进一步需要说明的是，步骤1.5)具体步骤为：用1×PBS悬浮细菌沉淀并超声处理10min，每超声10s就间歇10s，离心取上清，与经1×PBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶在室温振荡混合30min，将混合物转移至层析柱中，用1×PBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。需要说明的是，步骤S2的具体为：2.1)用proteinG采用多点注射法免疫阴性家兔2只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血；2.2)将4℃过夜沉淀的全血4000r/min离心10min，取上清即为血清；将20ml血清中加入20ml生理盐水，再加入10ml的饱和(NH4)2SO4溶液，使之成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合，静置30min；3000r/min离心20min，弃去沉淀除去纤维蛋白；在上清中加入30ml(NH4)2SO4饱和溶液，使成50％的(NH4)2SO4溶液，充分混合，静置30min；3000r/min离心20min，弃上清；于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，充分混合，静置30min；3000r/min离心20min，弃上清；2.3)重复步骤2.2)2-3次；2.4)用10ml生理盐水溶解经步骤2.3)后最终得到的沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次；以1％BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+，直至无SO42-或NH4+出现为止；离心去沉淀，去除杂蛋白，上清液即为粗提IgG，纯化后得ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；所述以纳氏试剂检查NH4+的方法为取3-4ml透析液，加试剂1-2滴，出现砖红色即认为有NH4+存在。需要说明的是，步骤S3的方法具体如下：3.1)胶体金颗粒的制备100ml水中加入1ml1％的氯金酸水溶液，加热至沸，边搅拌边逐滴加入1.7ml1％的柠檬酸钠三钠水溶液，继续煮沸15mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条，包括支撑层、加样层、检测层和吸收层；其特征在于，还包括金标蛋白释放垫，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的重组蛋白G；所述检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；所述优势抗原表位肽序列为ORF2上的氨基酸区段113‑147aa的基因片段。

【技术特征摘要】
1.猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条，包括支撑层、加样层、检测层和吸收层；其特征在于，还包括金标蛋白释放垫，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的重组蛋白G；所述检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有兔ProteinG高免血清纯化后的IgG；所述优势抗原表位肽序列为ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段。2.一种权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1制备所述优势抗原表位肽；S2制备兔ProteinG高免血清，并纯化血清中的IgG；S3胶体金颗粒的制备，并采用胶体金标记重组蛋白G并用玻璃纤维吸附，得到金标蛋白释放垫；S4制备检测层，步骤S1制备得到的优势抗原表位肽和步骤S2制备得到的兔ProteinG高免血清纯化后的IgG分别包被于硝酸纤维膜上得到检测带和质控带，构成检测层；S5将加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层设于支撑层上。3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的方法具体为：1.1)根据ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段，设计并合成1对引物：ORF2-EF：5’-GCGGATCCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCT-3’ORF2-ER：5’-GCCTCGAGTTAGCGGGAGGAGTAGTTTACA-3’；引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；1.2)以ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段为模板，利用步骤1.1)设计得到的引物对进行PCR处理；1.3)将ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段在pGEX-4T-1中进行克隆，得到的阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C；1.4)将步骤1.3)得到的重组质粒pGEX-ORF2-C转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达，将表达后的蛋白命名为GST-ORF2-C；1.5)谷胱甘肽亲和层析柱层析法纯化GST-ORF2-C，即得优势抗原表位肽。4.根据权利要求3所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1.2)中，PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。5.根据权利要求3所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1.3)具体方法为：DNA快速连接酶连接，连接体系为：10×ligasebuffer1μl，酶切纯化的目的基因片段5μl，载体pGEX-4T-11μl，T4DNA快速连接酶1μl，双蒸水补足10μl，室温连接15min；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺LB平板于37℃培养过夜，挑取单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，张韵，郭慧琛，智晓莹，魏衍全，常艳燕，郜原，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62