未知序列的双股线性核酸的全长扩增方法技术

本发明专利技术揭露了一种用以扩增样本中未知序列的所有线性、双股核酸分子的转接子(adaptor)。该转接子包含(1)第一个寡核苷酸(称为P‑oligo):在5’端带有磷酸，且在3’端不带有额外的T(胸腺嘧啶)核苷酸(nucleotide)；以及(2)第二个寡核苷酸(称为T‑oligo):3’端带有额外的T，但5’端不带有磷酸。除了在该T‑oligo内的3’‑T之处，P‑oligo与T‑oligo在序列上互补，所以可以形成双股的转接子。该转接子与未知序列的核酸(即目标核酸)中3’端上额外的腺嘌呤(3’‑A)接合，形成”转接子‑目标核酸”的结构。该T‑oligo接着被作为用于T oligo‑引发的聚合酶链式反应(T oligo‑primed polymerase chain reaction，TOP‑PCR)的唯一引物(primer)，藉以扩增整段未知序列的核酸分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要关于DNA增殖。
技术介绍
测序技术的进步已为癌症突变检测提供了一个更好的选择。第二代测序技术(Next-generationsequencing，NGS)是一种具有优越分辨率足以侦测单一核苷酸的差异的尖端技术。然而，NGS在来自循环血浆DNA(cpDNA)，其中可能带有少量的肿瘤循流DNA(circulatingDNA，ctDNA)，的癌症突变分析上的应用仍处于早期阶段。这是因为在血浆内的DNA含量极低，且并无可靠的方法可以自血浆中扩增少量DNA。一般通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)的DNA扩增方式使用一个或多个成对(pair)的引物(primer)来界定目标区域(targetregions)的边界以及通过嗜热性DNA聚合酶提供合成作用。当应用于线性DNA的全长扩增时，使用成对引物的策略有本质上的缺点，因为每个目标DNA(targetDNA)片段的末端必需接合两种不同的转接子(adaptors)，其会使不同的PCR引物连接而进行环状DNA扩增。因为每个目标DNA的末端具有相同的机会与任一转接子连接，一半的目标DNA片段仅与一种转接子接合，造成有50％的机会损失序列信息，因为这样的片段无法以指数速率扩增，因此在测序与下游分析时会错误地造成代表性不足。当涉及到低含量DNA分子的NGS分析时，这个问题会变得很严重，例如在单一细胞转录组(transcriptome)内的低含量分子或在体液样本内的低含量DNA分子，如血浆，其中目标DNA或RNA种类的主要部分含量都远低于测序基因库(sequencinglibrary)的建构或一般实验室仪器定量的最低含量要求。当考虑到疾病诊断时，这问题又会变得更为严重，因为每天要检验大量的临床DNA样本，而且有各种不良因素，例如石蜡包埋、长期或不当的储存，量少或浓度低，样本少或质量差。因此，极需要一种在样本中有效且非选择性的DNA扩增方法，可把“所有”DNA/RNA分子当作目标并且扩增，而不偏好任何序列。
技术实现思路
本专利技术涉及一种称为“T-寡核苷酸引发的聚合酶链式反应(T-oligoprimedPCR，TOP-PCR)”的新方法的研发。一方面，本专利技术涉及一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法。该方法包含以下步骤：(a)提供未知序列、线性、双股的目标核酸；(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股核酸的3’-尾端使成为带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)的未知序列的核酸；(c)提供带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸(oligo)；(d)提供带有3’-胸线嘧啶核苷酸(3’-T)且不带有5’-磷酸(5’-p)之第二股寡核苷酸(oligo)，该带有3’-T的第二股寡核苷酸与该带有5’-p的第一股寡核苷酸在除了该第二股寡核苷酸的3’-T以外之处互补；(e)使第一与第二股寡核苷酸退火(anneal)以产生带有3’-T突出端的同类转接子(homogeneousadaptor)；(f)接合(ligate)该转接子至该带有3’-A突出端的未知序列的目标核酸上，以形成“转接子-未知序列的目标核酸”的结构，使之带有贴附于其上每一端的转接子；以及(g)进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)，以该未知序列的转接子-接合的目标核酸作为模板(template)，且以该带有3’-T的第二股寡核苷酸作为唯一引物(primer)，以获得PCR产物，使其中该未知序列的核酸的全长被扩增。在本专利技术的一个实施方式中，该方法包含只有一次连接(ligation)步骤。在本专利技术的另一实施方式中，该转接子不会自我接合。在本专利技术的另一实施方式中，该未知序列的线性、双股核酸为体液DNA。在本专利技术的另一实施方式中，该未知序列的线性、双股核酸为获自于癌症病患的血浆的循流DNA。在本专利技术的另一实施方式中，该转接子具有一3’-T突出端与一3’-非A突出端。在本专利技术的另一实施方式中，该转接子具有一3’-突出端与一平端。另一方面，本专利技术涉及一种用于癌症特异性突变的评估及/或用于癌症诊断的方法。该方法包含下列步骤：(i)根据权利要求1所述的扩增未知序列的线性、双股核酸的全长，以获得PCR产物，其中该线性、双股核酸为来自病患的体液循环DNA(circulatingDNA，ctDNA)；(ii)测序该PCR产物以获得该体液ctDNA的序列；(iii)定位(map)该体液ctDNA的序列相对于在公众已知的基因(genome)序列数据库中的位置，以辨识序列变异的存在与否；(iv)当序列变异的存在被辨识出时，在该体液ctDNA与来自血沉棕黄层(buffycoat)、白血球细胞的DNA、与基因库的序列进行交叉比对；(v)基于该交叉基因库比对的结果，评估癌症特异性突变或正常变异的存在与否。在本专利技术的一个实施方式中，前述方法需要下列元素：(1)该测序步骤为与来自相同个体的血沉棕黄层或白血球细胞的基因组DNA(genomicDNA)并行进行；(2)该定位步骤为通过定位该体液ctDNA的序列以及该血沉棕黄层或白血球细胞的基因组DNA的序列相对于在该公众已知的基因组序列(genomicsequence)数据库中的位置而进行；(3)该交叉基因库比对辨识在该体液ctDNA内以及在该血沉棕黄层或白血球细胞DNA内的变异；以及(4)该评估步骤进一步包含自在该体液ctDNA中发现的变异减去在该血沉棕黄层或白血球细胞DNA内的变异，以辨识潜在的癌症突变。在本专利技术的另一个实施方式中，该变异选自SNPs、插入，以及缺失。在本专利技术的另一实施方式中，在步骤(b)之前该方法进一步包含对该未知序列的线性、双股核酸或该体液ctDNA进行末端修复(end-repair)反应。在本专利技术的另一实施方式中，该体液选自血液、唾液、精液、阴道分泌物，以及羊水。在本专利技术的另一实施方式中，该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于20个拷贝数。在本专利技术的另一实施方式中，该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于10个拷贝数。在本专利技术的另一实施方式中，该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于5皮克(picogram,pg)。在本专利技术的另一实施方式中，该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于0.01皮克(picogram)。在本专利技术的另一实施方式中，该未知序列的转接子接合的目标核酸不会环状化或形成环形核酸。在本专利技术的另一实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法，其包含以下步骤：(a)提供该未知序列的线性、双股的目标核酸；(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股核酸的3’‑尾端，以获得带有3’‑腺嘌呤核苷酸(3’‑A)突出端的未知序列的目标核酸；(c)提供带有5’‑磷酸(5’‑p)的第一股寡核苷酸(oligo)；(d)提供带有3’‑胸线嘧啶核苷酸(3’‑T)但不带有5’‑磷酸(5’‑p)的第二股寡核苷酸(oligo)，该带有3’‑T的第二股寡核苷酸与该带有5’‑p的第一股寡核苷酸在除了该第二股寡核苷酸的3’‑T以外之处互补；(e)使该第一与第二股寡核苷酸退火，以产生带有3’‑T突出端的同类转接子；(f)将该同类转接子接合至该带有3’‑A突出端的未知序列的目标核酸上，以形成“转接子‑未知序列的目标核酸”的结构，使之带有贴附于其上每一端的转接子；以及(g)执行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，以该“转接子‑未知序列的目标核酸”作为模板，且以该带有3’‑T的第二股寡核苷酸作为单一引物，以获得PCR产物，其中该未知序列的核酸的全长被扩增。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.15 US 61/916,2711.一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法，其包含以下步骤：
(a)提供该未知序列的线性、双股的目标核酸；
(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股核酸的3’-尾端，以获得带有
3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)突出端的未知序列的目标核酸；
(c)提供带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸(oligo)；
(d)提供带有3’-胸线嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸
(oligo)，该带有3’-T的第二股寡核苷酸与该带有5’-p的第一股寡核苷酸在除了该第二股
寡核苷酸的3’-T以外之处互补；
(e)使该第一与第二股寡核苷酸退火，以产生带有3’-T突出端的同类转接子；
(f)将该同类转接子接合至该带有3’-A突出端的未知序列的目标核酸上，以形成“转接
子-未知序列的目标核酸”的结构，使之带有贴附于其上每一端的转接子；以及
(g)执行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)，以该“转接子-未知序列
的目标核酸”作为模板，且以该带有3’-T的第二股寡核苷酸作为单一引物，以获得PCR产物，
其中该未知序列的核酸的全长被扩增。
2.如权利要求1所述的方法，其包含只有一次的连接步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该转接子不会自我接合。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中该未知序列的线性、双股核酸为体液DNA。
5.如权利要求1所述的方法，其中该未知序列的线性、双股核酸为获自癌症病患的血浆
的循环DNA。
6.如权利要求1所述的方法，其中该转接子具有3’-T突出端与3’-非A突出端。
7.如权利要求1所述的方法，其中该转接子具有3’-突出端与平端。
8.一种用于癌症特异性突变的评估及/或用于癌症诊断的方法，其包含下列步骤：
(i)根据权利要求1所述扩增未知序列的线性、双股核酸的全长，以获得PCR产物，其中
该线性、双股核酸为来自病患的体液循环DNA(circulatingDNA，ctDNA)；
(ii)测序该PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱国平，乃育昕，
申请(专利权)人：中央研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71