一种酶修复等温循环放大荧光法检测沙门氏菌的方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，特别涉及基于酶修复循环三次放大的荧光生物检测方法，包括拱形探针的构建；酶修复循环信号放大、荧光检测；利用了核酸适配体的特异性识别，利用核酸适配体对目标物沙门氏菌的高特异性检测；利用酶修复循环放大，实现信号放大的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测方法，特别涉及循环方法荧光法检测沙门氏菌的方法。
技术介绍
沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是革兰氏阴性、细胞内寄生的一种肠道菌。该菌广泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，对人类造成很大威胁。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌每年会导致约四万美国人病倒，约600人死亡。在我国沙门氏菌是食物中毒中最常见的致病菌，占食物中毒的第一位。沙门氏菌病的临床症状主要包括头痛、腹痛、发热等，死亡率在1%，对人危害很大。目前报道的检测沙门氏菌的方法包括传统的培养方法、酶联免疫法、PCR技术等。传统的沙门氏菌检测方法检测周期长达一周，工序繁琐，设备昂贵等，这远远不能满足要求。因此，食品工业急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对食品中的沙门氏菌进行检测。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测沙门氏菌的方法中特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于酶修复循环放大的荧光法检测沙门氏菌的方法。本专利技术还提供了基于核酸内切酶IV修复循环放大的荧光检测沙门氏菌的生物传感器的制备方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：本专利技术中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：Trigger：5’-TCTTTTCCAAAACGGGCATTACT-3’（SEQIDNO:1）；Aptamer:5’-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3’（SEQIDNO:2）；HAP：5’-CTTGCGCTTGAGCCCTGTGTCCCGTCATGCGAGTAATGCCC-3’（SEQIDNO:3）；Signalprobe：5’-（FAM）CTTGXGCTTG（Dabcyl）-3’（SEQIDNO:4）；其中Signalprobe的5’端修饰荧光基团FAM，3’端修饰猝灭基团Dabcyl。HAP既用作聚合酶合成DNA的模板，又可以在UDG和核酸内切酶IV的作用实现信号的放大，同时产生与Signalprobe互补的D’链。HAP总共包括四部分和两个酶切位点分别是：A（黑体部分）能够与Trigger部分互补，在聚合酶作用下Trigger作引物，HAP为模板，进行DNA链的延长。B（黑体下划线部分）维持发夹的稳定和两个酶切位点。C（斜体部分）用于诱导进一步的循环放大，产生的C’与其完全互补，且C’也能够打开发夹实现另一个循环。D（斜体下划线部分）产生与Signalprobe完全互补的D’，D’与Signalprobe通过碱基互补配对形成双链，在核酸内切酶IV作用下，将Signalprobe剪切成两部分，使得荧光基团（FAM）和猝灭集团（Dabcyl）分离，从而产生荧光信号。通过测量荧光强度来定量检测沙门氏菌。本专利技术中沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过BstDNA聚合酶、UDG和核酸内切酶IV的配合实现三循环，使得信号放大，从而实现沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。均相中发生的反应主要有：Trigger与Aptamer进行碱基互补配对形成拱型结构。当有沙门氏菌存在时，Aptamer与沙门氏菌进行结合，这可以将拱型结构打开，同时使得Trigger释放。释放出的Trigger可以与HAP的A部分进行碱基互补配对，在BstDNA聚合酶和dATP、dCTP、dGTP和dUTP存在下以Trigger为引物，HAP为模板进行DNA的延伸。（注：dUTP是用于代替dTTP来产生酶切位点(AP位点)）复制的DNA模板所得的链包含两个尿嘧啶（U）,这两个尿嘧啶能够被糖基化酶（UDG）切割，产生两个碱基空位（AP位点），随后，在核酸内切酶IV的作用下进行剪切，C’和D’片段从双链中剪切下来，剩余双链部分在BstDNA聚合酶、UDG和核酸内切酶IV作用下实现第一次循环。此外，产生的C’能够再次打开HAP并且在聚合酶的作用下进行DNA的延伸，实现第二次循环。产生的D’与Signalprobe进行碱基互补配对形成双链，核酸内切酶IV能够剪切Signalprobe中间的四氢呋喃碱基位点（TAP位点）使得Signalprobe断裂且与D’分开，从而产生荧光信号，分开的D’能够与其他的Signalprobe再次进行碱基互补配对，实现第三次循环。通过这三次的循环实现信号的放大。在均相反应中，拱形探针的形成反应条件均为95℃，反应时间是5min，缓慢冷却至室温。拱形探针与目标菌孵育以及三步放大的反应温度均为37℃，反应时间是2h。所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）拱形探针的构建；（2）将目标菌与拱形探针加入到均相中，同时加入HAP、Signalprobe、BstDNA聚合酶、UDG和核酸内切酶IV，37℃，孵育2h；所述的制备方法，具体的操作步骤如下：（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、20μM的Aptamer1μL和20μM的Trigger1μL加入EP管中，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温；（2）在37℃下，向EP管中加入目标菌，向EP管中加入10μMHAP1μL、10μMSignalprobe1μL、1μLBstDNA聚合酶、1μLUDG和1μL核酸内切酶IV，37℃，孵育2h；（3）将上述反应后的溶液10μL稀释至70μL，荧光仪激发波长设置为486nm，用荧光仪在518nm处检测荧光。该专利技术的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将Aptamer和Trigger形成拱形探针。然后将目标菌加入到反应后的均相溶液，在37℃孵育2h，目标物与aptamer结合，释放Trigger序列，并与HAP结合，在BstDNA聚合酶、UDG和核酸内切酶IV作用下完成三步放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为486nm，检测518nm处荧光强度。本专利技术基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链延伸功能的BstDNA聚合酶实现链的延伸，产生大量与Signalprobe互补的D’，BstDNA聚合酶、UDG和核酸内切酶IV的配合的酶修复循环放大作用以及荧光基团与猝灭基团的荧光共振能量转移构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。本专利技术的有益效果：1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用适配体与沙门氏菌的结合实现了对目标物的<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶修复等温循环放大荧光法检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）拱形探针的构建；（2）将目标菌与拱形探针加入HAP、Signal probe、Bst DNA 聚合酶、UDG和核酸内切酶IV，37℃，孵育2 h；（3）荧光仪检测；所述HAP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述Signal probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

【技术特征摘要】
1.一种酶修复等温循环放大荧光法检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）拱形探针的构建；
（2）将目标菌与拱形探针加入HAP、Signalprobe、BstDNA聚合酶、UDG和核酸内切酶
IV，37℃，孵育2h；
（3）荧光仪检测；
所述HAP的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
所述Signalprobe的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体的操作步骤如下：
（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、20μM的Aptamer1μL和20μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，冷雪琪，王玉，刘素，王虹智，郭玉娜，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37