一种基于转录因子ZEB1在制备促进乳腺癌化疗敏感性的药物中的应用，即转录因子ZEB1可介导乳腺癌的化疗耐药，通过靶向干预ZEB1可增加乳腺癌对化疗的敏感性。一方面，ZEB1可通过促进DNA损伤修复方式促进乳腺癌的化疗耐药，而这种化疗耐药的产生是通过ZEB1对ATM的调控实现的。另一方面，ZEB1可与P300和/或PCAF形成复合物，该复合物行使了对ATM的调控作用。同时，利用ZEB1‑shRNA慢病毒基因敲减系统，经过对乳腺癌细胞系及体内裸鼠模型，证实了Le‑shZEB1在增强抗肿瘤药物抗肿瘤疗效中的作用，有效的解决了乳腺癌对化疗的耐受问题。本发明专利技术为缓解乳腺癌化疗耐药，及增加化疗药物的敏感性等问题的解决提供了新的靶点和治疗策略。
【技术实现步骤摘要】
基于转录因子ZEB1在制备促进乳腺癌化疗敏感性的药物中的应用
本专利技术涉及转录因子ZEB1的新用途以及提高化疗敏感性的相关基因，特别涉及基于转录因子ZEB1提高乳腺癌化疗敏感性药物制备中的应用，属于肿瘤药物制备的
技术介绍
乳腺癌(BreastCancer)已成为世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，也是全球女性因肿瘤相关疾病死亡的首要原因。尽管由于乳腺外科技术、新辅助治疗和靶向药物等综合治疗技术的发展，目前早期乳腺癌5年生存率在一些发达国家已提高至85％以上，但晚期乳腺癌或复发转移性乳腺癌五年生存率仅有23％。而乳腺癌化疗耐药的发生则成为导致这一严酷事实的主要原因之一。DNA损伤类药物，例如，表柔比星、依托泊苷等，主要是通过造成DNA双链损伤来杀伤肿瘤细胞。但因其毒副作用大，并且容易出现化疗耐药，使其临床应用受到了很大的制约。因此，揭开乳腺癌化疗耐药的分子机制，寻找和发现参与乳腺癌化疗耐药的关键靶点，降低其毒副作用，就成为提高化疗敏感性的重要手段。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供基于转录因子ZEB1在制备促进乳腺癌化疗敏感性的药物中的应用，抑制ZEB1表达可提高乳腺癌化疗疗效，为有效提高乳腺癌的临床疗效提供新的药物靶标选择。ZEB1是调控上皮-间质转化过程的重要转录因子，ZEB1已被证实在多种实体肿瘤中高表达，对肿瘤的发生、发展和远处转移具有显著影响，因此ZEB1可作为肿瘤防治特别是肿瘤个体化治疗的关键靶点。本专利技术首先提供了转录因子ZEB1在制备抗乳腺癌的药物及其逆转乳腺癌化疗耐药的应用。所述转录因子ZEB1通过转录激活作用，增加ATM在乳腺癌中的激活。转录因子ZEB1通过对转录激活因子P300、PCAF的招募，激活ATM在乳腺癌中的表达。所述的药物为Le-shZEB1以及与化疗药物联合使用的药物。本专利技术所述的基于转录因子ZEB1在制备促进乳腺癌化疗敏感性的药物中的应用，通过以下步骤实现：1.ZEB1高表达与乳腺癌化疗耐药相关性的探讨(1)免疫组织化学方法检测ZEB1在化疗耐药的人乳腺癌组织和非耐药的乳腺癌组织中的表达情况。一共检测233例人乳腺癌组织，其中耐药病例69例(评价标准按WHO肿瘤化疗疗效评价标准执行)，非耐药病例164例(评价标准同前)。经统计，ZEB1在化疗耐药的乳腺癌组织中的表达显著高于其在非耐药组织中的表达，差异具有统计学意义(P＝0.006)；(2)免疫组织化学方法检测ZEB1与经典化疗耐药分子Bcl-xl、CyclinD1的相关性。通过对139例原发性乳腺病例进行免疫组织化学染色，确定ZEB1与抗凋亡蛋白Bcl-xl(P＝0.01,r＝0.343)及细胞周期蛋白CyclinD1(P<0.01,r＝0.432)呈正相关的关系。进一步明确ZEB1在乳腺癌化疗耐药过程中的作用；2.转录因子ZEB1在制备增加乳腺癌对化疗药物敏感性的药物中的应用。(1)Le-shZEB1的制备及鉴定，并且通过体外的CCK-8实验证实Le-shZEB1可增加化疗药物表柔比星(Epirubicin)和依托泊苷(Etoposide)对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制作用；(2)通过Westernblot和细胞免疫荧光(Immunofluorescence)证明Le-shZEB1可以促进DNA损伤标记物γH2AX的产生。3.转录因子ZEB1下游靶基因的确定。(1)通过Chip-seq方法，初步筛选出147个ZEB1候选靶基因；(2)通过文献检索从147个候选基因中找到9个与化疗耐药相关的靶基因(ATM,NLGN1,CLASP1,CD4,RPS6KB1,BIRC3,PIM3,KIF2C,SLC3A2)；(3)利用TCGAdatabase分析ZEB1与上述9个候选靶基因的相关性，明确ZEB1和ATM具有显著的正相关关系(P<0.01,r＝0.484)。(4)利用QPCR方法在mRNA水平进一步确定ZEB1与上述9个候选靶基因的关系，证实ZEB1与ATM的正向调控作用。4.转录因子ZEB1对ATM的转录调控，增加ATM在乳腺癌中的激活。(1)对ATM启动子进行分析，确定在ATM启动子距离转录起始位点(TSS)-849bp的位置，存在一个潜在的ZEB1结合元件E2-box序列(GAGGTG)；(2)通过分子生物学方法设计并克隆ATM启动子的不同长度的截短序列以及E2-box位点的突变序列，利用双荧光素酶报告系统确定ZEB1结合到ATM启动子的E2-box，并且转录激活ATM；(3)通过免疫染色质免疫共沉淀技术(Chromatinimmunoprecipitation，ChIP)，验证ZEB1通过结合ATM启动子的E2-box，转录激活ATM；(4)通过免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)，确定ZEB1/P300/PCAF复合物的存在，并进一步通过ChIP确定ZEB1与P300、PCAF形成复合物后，与ATM启动子的E2-box结合，从而发挥了相应的调控作用；(5)利用Westernblot、免疫组织化学以及QPCR等方法，分别从蛋白水平和mRNA水平确定，ZEB1对ATM的正向调控作用。5.ZEB1调控ATM介导乳腺癌化疗耐药的探讨(1)构建ZEB1过表达乳腺癌细胞系中沉默ATM的稳定细胞系；(2)CCK-8方法证明ATM沉默对ZEB1介导的表柔比星化疗耐药具有逆转作用；(3)Westernblot和免疫荧光方法证明ATM沉默可增加表柔比星诱导的肿瘤细胞的DNA损伤；(4)利用ATM特异的小分子抑制剂(KU55933，10μM)，重复上述研究，再次确定ZEB1介导的乳腺癌细胞对表柔比星的耐受是通过调控ATM实现的。6.转录因子ZEB1通过对转录激活因子P300、PCAF的招募，激活ATM在癌中的表达。7.ZEB1对ATM的调控机制在制备抗乳腺癌药物中的应用。(1)Le-shATM的制备及鉴定，并且通过体外的CCK-8实验证实Le-shATM可增加化疗药物表柔比星(Epirubicin)和依托泊苷(Etoposide)对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制作用；(2)通过Westernblot和细胞免疫荧光(Immunofluorescence)证明Le-shATM可以促进DNA损伤标记物γH2AX的产生。8.ZEB1调控ATM介导乳腺癌化疗耐药的体内研究(1)选择4-6周龄的雌性裸鼠，每组5只。以1.5×106/只的数量，分别接种野生型人乳腺癌细胞MDA-MB-231及ZEB1过表达细胞系MDA-MB-231/ZEB1；(2)待肿瘤生长至体积为100mm3时，采用隔天腹腔给药的方式，给予表柔比星化疗(5mg/kg)；(3)每隔三天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，以绘制生长曲线；(4)接种4周后，处死裸鼠，测量肿瘤的瘤重及体积；(5)将取下的瘤体标记，4％多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片并进行病理染色，检测不同处理组中ZEB1及ATM的表达情况。本专利技术的优点和积极效果：ZEB1/P300/PCAF复合物对ATM的转录激活作用，提供了促进乳腺癌化疗敏感性的新应用。利用这一机理，可以设计特定的靶向治疗方案，并可以应用于相关药物的制备(Le-s本文档来自技高网...
【技术保护点】
转录因子ZEB1在制备增加乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.Le-shZEB1在制备增加乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的药物中的应用，其中所述Le-shZEB1的制备方法如下：(1)在线设计并合成ZEB1shRNA序列；(2)将ZEB1shRNA序列退火后连接至载体质粒pLV-H1-EF1α-puro上，双酶切鉴定目的质粒是否构建成功；其中退火条件为95℃，5分钟；双酶切中的酶为BamH1，Sac1；(3)将上述构建成功的目的质粒，利用Letivirus系统进行病毒包装，并测定病毒滴度，构建Le-shZEB1：a.将293T细胞以每孔1.0×106个细胞的量铺于6孔板中，待细胞密度达到90％左右时，转染细胞；b.取一无菌的1.5ml离心管，向其中加入7.5μlLipofectamine2000和250μlOpti-MEM，温和混匀，室温静置5min；c.取另一无菌的1.5ml离心管，向其中加入1.5μg目的质粒，1.5μg包装质粒和250μlOpti-MEM，震荡混匀；所述包装质粒为0.5μgGag-pol+0.5μgRev+0.5μgVSV-G；d.将步骤b的组分和步骤c的组分混合，温和混匀，室温静置20min；e.移去六孔板内的旧培养基，小心加入1ml新鲜的全培养基，并将步骤d的混合液加入到六孔板中，常规培养12-16小时后换液，每孔加入3ml全培养基；f.换液24小时后收上清并测定滴度，既为Le-shZEB1。2.根据权利要求1所述的应用，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨爽，张翔，张震，向荣，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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