纯化达依泊汀α的方法技术

技术编号:13343223 阅读:58 留言:0更新日期:2016-07-14 09:12
本发明专利技术涉及通过从具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α结构同种型的混合物只选择性地分离具有高含量唾液酸的结构同种型而纯化达依泊汀α的方法。由于本发明专利技术的方法是纯化达依泊汀α的新方法,达依泊汀α可以方便且简单地产生,所以根据本发明专利技术,当大量生产达依泊汀α时,由于工艺效率的提高而显著地增加生产率以及产生高纯度达依泊汀α是可能的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景1.专利
本专利技术涉及通过从具有多种含量的唾液酸的达依泊汀(darbepoetin)α结构同种型的混合物只选择性地分离具有高含量唾液酸的结构同种型而纯化达依泊汀α的方法。2.相关技术的描述达依泊汀α(NESP)是红细胞生成素(EPO)的类似物,其在红细胞生成素分子的氨基酸序列中具有五个取代基,提供两个另外的N-糖基化链(国际公布号WO2001076640)。虽然达依泊汀α与EPO在生物化学特性如分子量、等电点等方面不同,但是它像EPO一样也是红细胞生成刺激蛋白。已知达依泊汀α由于它的高唾液酸含量而具有比在小鼠、大鼠、狗、人等中的红细胞生成素长约三倍的血清半衰期(PedrazzoliP,CinieriS,LorussoV,GamucciT,SecondinoS,SilvestrisN2007Nov-Dec,27(6C),4419-24;AnticancerRes.),并且因此它的体内分解被抑制,由此提供比在其天然状态的EPO更高的生物活性。达依泊汀α,由于糖基化引起的唾液酸含量的差异,最大具有22种不同类型的结构同种型,并且唾液酸含量越高,等电点越低,治疗价值越高。因此,仅具有高唾液酸含量的结构同种型的选择性分离和纯化在利用达依泊汀α的治疗领域是非常重要的。纯化EPO和EPO类似物的常规方法的实例包括阴离子交换和阳离子交换层析、疏水作用层析、分子排阻色谱等。具体地,国际公布号WO2010/027869公开了通过顺序地应用疏水作用、阴离子交换、阳离子交换和尺寸排阻色谱纯化EPO的方法。国际公布号WO2003/045996公开了通过进行反相色谱、阴离子交换层析和尺寸排阻色谱纯化重组人EPO的方法。特别地,作为纯化达依泊汀α的方法,国际公布号WO1995/005465公开了应用阴离子交换树脂和C4树脂的方法,国际公布号WO2010/008823提出了针对具有高唾液酸含量的、等电点为4.5或更低的达依泊汀α的纯化的流通模式,其中靶蛋白没有结合到阳离子交换树脂柱,而是在层析处理溶液中流出。然而,由于这些方法使用多个树脂步骤,它们需要非常高的成本和大量时间,因此不适合大规模生产。同时,韩国专利申请公布号10-2013-0042107公开了一种通过采用顺序地应用阴离子、羟基磷灰石、阴离子交换层析的三步过程,并且为了具有低等电点的同种型的选择性分离,当应用第二阴离子交换树脂层析时在特定的pH条件下进行吸附和清洗的方法,其比上面的四步过程更简单。特别地,为了获得具有低等电点的同种型,将达依泊汀α在4.0至5.0的pH下结合到柱,之后用具有2.0至2.4的pH的缓冲溶液清洗。上述方法在大规模生产中要求的时间和成本方面可以是有利的,因为该过程与常规过程相比简单一点,然而,对于如在上面公布的专利申请中所提出的低pH条件(2.2至2.4的pH)的实施方式,有毒的、酸性溶液如HCl大量使用是必需的,因此该方法不是令人想要的。另外,由于当将被柱处理的量在放大时增加时,在给定的pH条件下的同种型反应不是恒定的,所以当具有期望的等电点范围的同种型将通过控制缓冲溶液的pH条件而获得时,大规模生产中再现性的可能性低。也就是说,由于纯化达依泊汀α的常规方法需要利用由多个树脂步骤组成的层析的复杂过程,所以它需要非常高的成本和大量时间,并且当纯化利用与常规方法相比简化的方法进行时,条件如pH被精确控制是必需的,以补偿可被减少的纯化效果,但是随着生产规模变得更大,控制条件变得更困难。正因为如此,存在对纯化达依泊汀α的改进的方法的渐增的需求,该方法比常规方法更简化并具有更容易控制的工艺条件,当该方法应用于大规模生产时可稳定地再现成功的工艺条件同时减少成本和时间。专利技术概述本专利技术人努力开发与常规方法相比具有改进的便利和简单的纯化达依泊汀α的方法,因此已令人惊讶地发现只利用阴离子和精氨酸的简单方法可在短时期里分离具有高唾液酸含量的达依泊汀α,从而完成本专利技术。因此,本专利技术的目的是提供从具有多种唾液酸含量的达依泊汀α结构同种型的混合物纯化具有高唾液酸含量的达依泊汀α的方法。专利技术的有益效果本专利技术的方法是纯化达依泊汀α的新方法,达依泊汀α可以方便且简单地产生,并且根据本专利技术,在大规模生产的时候,由于工艺效率的提高而显著地增加生产率以及产生高纯度达依泊汀α是可能的。附图简述图1显示通过阴离子交换-羟基磷灰石树脂层析的纯化获得的达依泊汀α的洗脱物通过C4HPLC分析的纯度。图2显示将含有精氨酸的甘氨酸-HCl缓冲溶液应用到其中的阴离子交换层析的IEF(等电聚焦)结果。图3显示将含有精氨酸的乙酸钠缓冲溶应用到其中的阴离子交换层析的IEF结果。图4显示将没有精氨酸的甘氨酸-HCl缓冲溶液应用到其中的阴离子交换层析的IEF结果。图5显示通过阴离子交换层析获得的达依泊汀α部分的凝胶过滤层析结果。图6显示IEF结果,其显示图5中每个部分的等电点。优选实施方式的详细描述为了实现上述目的,一方面,本专利技术提供从具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α结构同种型的混合物纯化达依泊汀α的方法。具体地,为了从达依泊汀α结构同种型的混合物选择性分离具有高含量唾液酸的结构同种型,本专利技术提供通过包括用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗的阴离子交换层析纯化达依泊汀α的方法。优选,根据本专利技术的纯化达依泊汀α的方法包括进行至少一个阴离子交换层析,其中阴离子交换层析的进行包括将达依泊汀α结构同种型的混合物结合到阴离子交换树脂,用含有精氨酸的缓冲溶液清洗树脂,和从柱洗脱结合到层析柱的达依泊汀α。在另一个示例的实施方式中,本专利技术提供纯化达依泊汀α的方法,包括以下步骤:(a)通过将含有具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α的混合物装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到阴离子交换层析柱;(b)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗层析柱;和(c)从柱洗脱保持结合到层析柱的达依泊汀α。在示例的实施方式中,本专利技术提供纯化达依泊汀α的方法,包括以下步骤:(a)通过将包括达依泊汀α的生物流体施加到阴离子交换层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;(b)通过将步骤(a)中产生的洗出液施加到羟基磷灰石树脂层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;(c)通过将步骤(b)中产生的洗出液装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到阴离子交换层析柱;(d)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗步骤(c)中处理过的柱;和(e)从柱洗脱通过在步骤(d)中清洗而保持结合到层析柱的达依泊汀α。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
纯化达依泊汀α的方法,包括:(a)通过将包括具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α的混合物装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到所述阴离子交换层析柱;(b)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗所述层析柱;和(c)从所述柱洗脱保持结合到所述层析柱的所述达依泊汀α。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.29 KR 10-2013-01480261.纯化达依泊汀α的方法,包括:
(a)通过将包括具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α的混合物装载进阴离子交换层析柱
而将达依泊汀α结合到所述阴离子交换层析柱;
(b)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗所述层析柱;和
(c)从所述柱洗脱保持结合到所述层析柱的所述达依泊汀α。
2.权利要求1所述的方法,其中步骤(c)中洗脱的所述达依泊汀α具有pH2.0至4.0的等
电点。
3.权利要求1所述的方法,其中所述含有精氨酸的清洗缓冲溶液具有3.0至5.0的pH。
4.权利要求1所述的方法,其中所述含有精氨酸的清洗缓冲溶液进一步包括选自NaCl
和尿素的至少一种。
5.权利要求4所述的方法,其中所述清洗缓冲溶液包括处于5mM至90mM的浓度的
NaCl。
6.权利要求4所述的方法,其中所述清洗缓冲溶液包括处于3M至8M的浓度的尿素。
7.权利要求1所述的方法,其中步骤(b)是清洗具有比期望的等电点更高的等电点的达
依泊汀α结构同种型,以获得具有所述期望的等电点的达依泊汀α结构同种型。
8.权利要求1所述的方法,进一步包括在步骤(b)之前或之后用具有或没有精氨酸的清
洗缓冲溶液的清洗。
9.权利要求1所述的方法,进一步包括在步骤(b)之前用具有6至8的pH的清洗缓冲溶
液的所述柱的第一清洗;其中步骤(b)是用具有3至5的pH的含有精氨酸的清洗缓冲溶液的
所述柱的第二清洗。
10.权利要求9所述的方法,其中用于所述第一清洗的所述清洗缓冲溶液是磷酸钠溶液;
并且用于所述第二清洗的所述清洗缓冲溶液是甘氨酸-HCl溶液。
11.权利要求1所述的方法,其中所述生物流体是酵母培养物、植物细胞培养物、或动物
细胞培养物...

【专利技术属性】
技术研发人员:李允庭金炅嬅杨裕喜柳贞敏金世峻文智铉吴厚根李东亿李元祯李政缘李庭旼崔恩荣河敬植
申请(专利权)人:CJ医药健康株式会社
类型:发明
国别省市:韩国;KR

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