一种微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法技术

技术编号:13340169 阅读:231 留言:0更新日期:2016-07-13 14:58
本发明专利技术公开一种新的微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法,将自然筛选得到的新的菌株编号为CGMCC No.10804的茂源链霉菌发酵液经酒精沉淀后,进行阴离子交换层析,再经过脱盐、冷冻干燥后得到所述的微生物谷氨酰胺转氨酶。所得到的谷氨酰胺转氨酶纯度≧90%,内毒素水平≦0.02EU/mL,比酶活在25‑30U/mg之间,回收率≧70%。本发明专利技术工艺简单,成本低,酶活回收率高,得到的谷氨酰胺转氨酶纯度高,且此菌株发酵得到的微生物谷氨酰胺转氨酶性质稳定,便于工业化生产,为满足医药级的MTGase的规模化生产提供了一条切实可行的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术的分离纯化领域,具体涉及一种新的菌种所产谷氨酰胺转氨酶的分离纯化技术。
技术介绍
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,简称TGase,EC2.3.2.13)是一种催化酰基转移的转移酶,可催化蛋白质分子内和分子间ε-(γ-glutaminyl)lysine共价键的形成,从而催化蛋白质分子内、分子间发生交联,进而改变蛋白质的性质和功能。谷氨酰胺转氨酶广泛存在于植物、动物和微生物中。最早由学者在豚鼠肝脏中获得TGase,其在欧洲很长一段时间作为商业TGase的来源。资源稀有和动物来源的TGase复杂的分离纯化工艺导致酶的价格非常高,以至于不可能应用于工业规模的食品加工中。所以一些学者开始致力于从微生物中获得这种酶。后来Ando等最早从轮枝链霉菌培养基中发现微生物谷氨酰胺转胺酶(microbialtransglutaminase,MTGase),从而实现了大规模的发酵生产。同时微生物来源的谷氨酰胺转氨酶较动植物来源的谷氨酰胺转氨酶有很多优点,如微生物来源的谷氨酰胺转氨酶是钙非依赖性酶,底物特异性低。这些性质使得MTGase在各个领域得到广泛的应用。从1989年Ando等从轮枝链霉菌培养基中得到了谷氨酰胺转氨酶以后,专家学者们陆陆续续发现其他产TGase的链霉菌,如吸水链霉菌和茂源链霉菌等。不同链霉菌属来源的MTGase甚至同属不同种的链霉分泌的MTGase的性质也不完全相同。它们的热稳定性及pH稳定性有着很大的差异,从而影响后期的应用。目前筛选到的产MTGase的链霉菌并不是所有都可以转化到工业生产中。所以筛选到产酶效率高,MTGase稳定性高的链霉菌的任务迫在眉睫。而本专利技术中所提到的从自然界筛选到的茂源链霉菌所产的MTGase稳定性较之前的发现都要高。目前微生物来源的MTGase已经运用于工业化生产中。微生物经过发酵产生的MTGase经过简单的酒精沉淀后就可以运用于食品加工中。但这种方法得到的MTGase纯度低,杂质含量多且组分复杂。有研究发现,MTGase在生物制药领域有巨大的应用前景。比如MTG可以催化I型胶原蛋白发生交联,形成耐高温的胶;也可以交联明胶,形成良好的多孔网状物用于止血和伤口粘合(中国专利:200780051215.4、200980131973.6;美国专利:8133484;欧洲专利:WO2012017415、EP2303344);因此微生物谷氨酰胺转胺酶可作为潜在医用止血材料的交联剂用于止血、伤口粘合等外科手术中。但是,运用于食品领域的MTGase的纯度并不满足医药级别的要求。同时现有的传统分离纯化工艺复杂,成本高,制备过程中酶的得率、纯度以及比活力都不高,仍含有多种杂蛋白,难以满足作为医用材料的要求。本专利技术克服了目前存在的问题,得到了一条简单成本低的纯化工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成本低、回收率高、纯度高、适用于工业化生产且满足医药级要求的微生物谷氨酰胺转胺酶纯化方法,解决目前谷氨酰胺转胺酶纯化工艺复杂、成本高、回收率低、纯度低的问题。本专利技术方法分离纯化得到的微生物谷胺酰胺转胺酶符合医药级的要求。本专利技术方法中,所用菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的编号为CGMCCNo.10804,是通过自然筛选得到的茂源链霉菌,利用茂源链霉菌产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase)是目前通用的一种方法,而此菌株的特点在于其产酶效率高,所产的MTGase与现有的菌株所产MTGase相比,稳定性高,如图2所示,符合医药级的要求。本专利技术提出了一种茂源链霉菌(Streptomycessp.)菌株,是从土壤中自然筛选得到的一株新链霉菌菌株,菌丝形态如图1所示。经过16SrDNA序列的对比发现其不同于现有报道的其他链霉菌菌株,且通过neighbor-joining邻接法构建的基于本专利技术提出的菌株及相关菌株16SrDNA序列的系统进化树如图5所示。本专利提出的菌株处于StreptomycesmobaraensisNBRC13819、StreptomycesmobaraensisNRRLB-3729以及Streptomycessp.J1S1之间的未知链霉菌,黑色方框中的菌株即表示本专利技术提出的链霉菌,可以推测为新的野生菌株。其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2015年5月13日,保藏编号为CGMCCNo.10804。所述茂源链霉菌16SrDNA的测序结果如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提出了一种所述茂源链霉菌的培养方法:将所述茂源链霉菌在种子培养基中培养24-48h,培养温度为30℃,摇床转速为200r/min,然后,再转接到发酵培养基中培养45-52h,得到所述茂源链霉菌的发酵液;其中,所述发酵液中含有所述茂源链霉菌的次级代谢产物MTGase。具体地,所述茂源链霉菌的培养方法为:将筛选得到的菌株在种子培养基中培养24-48h,所述种子培养基的组成为(重量百分比):甘油1.5-2.5%,酵母膏0.3-0.8%,鱼粉蛋白胨2.1-2.7%,MgSO4·7H2O0.15-0.4%,K2HPO40.15-2.3%,pH为7.4,培养温度为30℃,摇床转速为200r/min。然后,再转接到发酵培养基中培养45-52h,得到大量的茂源链霉菌的次级代谢产物MTGase。其中,所述发酵培养基的组成为(重量百分比):甘油1.5-2.5%,酵母膏0.3-0.8%,鱼粉蛋白胨2.1-2.7%,MgSO4·7H2O0.15-0.4%,K2HPO40.15-2.3%,促进剂1-2%,pH为7.4,培养温度为30℃、摇床转速为200r/min。本专利技术微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法包括以下步骤:1、取茂源链霉菌发酵液上清,用预冷的无水乙醇1:1处理,静置1h后,8000r/mim离心15min,收集沉淀,得到MTGase的粗提物;2、将步骤1所得的粗提物溶于磷酸缓冲液中,室温下用AKTAavant25纯化仪进行阴离子交换层析,选用的纯化柱型号为HitrapQSepharoseFastFlow(1mL),平衡缓冲液、样品以及洗脱缓冲液的流速均为1mL/min,用线性洗脱的方式收集洗脱过程中出现的第一个洗脱峰;3、将步骤2回收得到的样品再进行脱盐,选用的脱盐柱型号为Hiprep26/10Desalting,样品及超纯水的流速均为10mL/min;4、将步骤3回收得到的样品进行冷冻干燥,最后得到高纯度的微生物谷氨酰胺转氨酶。本专利技术纯化步骤中所有的缓冲液和样品都要经过0.22nm的滤膜过滤除菌。所述步骤2中用阴离子交换层析方法进行纯化,与现有的纯化方法相比,方法新颖,步骤简单,只需要一步主要的阴离子交换层析就可以得到满足医药级纯度要求的MTGase,进而通过脱盐和冷冻干燥的方法可以得到无盐无杂质的精品MTGase,且冻干后的粉末状更适合后期应用、保存和运输。所用到的平衡缓冲液为15-25mMpH6.5-8.0的磷酸钠缓冲液,洗脱缓冲液为15-25mMpH6.5-8.0的磷酸钠本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种茂源链霉菌(Streptomyces sp.)菌株,其特征在于,是从土壤中自然筛选得到的一株新链霉菌菌株,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2015年5月13日,保藏编号为CGMCC No.10804。

【技术特征摘要】
1.一种茂源链霉菌(Streptomycessp.)菌株,其特征在于,是从土壤中自然筛选得到的一株新链霉菌菌株,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2015年5月13日,保藏编号为CGMCCNo.10804。
2.一种微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)取权利要求1所述的茂源链霉菌发酵液上清,用预冷的无水乙醇1:1处理,静置1h后,8000r/mim离心15min,收集沉淀,得到MTGase的粗提物;
(2)将步骤(1)所得的粗提物溶于磷酸缓冲液中,室温下用AKTAavant25纯化系统进行阴离子交换层析,选用的纯化柱型号为HitrapQSepharoseFastFlow(1mL),平衡缓冲液、样品以及洗脱缓冲液的流速均为1mL/min,用线性洗脱的方式收集洗脱过程中出现的第一个洗脱峰;
(3)将步骤(2)回收得到的样品再进行脱盐,选用的脱盐柱型号为Hiprep26/10Desalting,样品及超纯水的流速均为10mL/min;
(4)将步骤(3)回收得到的样品进行冷冻干燥,最后得到高纯度的微生物谷氨酰胺转氨酶。
3.根据权利要求2所述的微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法,其特征在于,所述方法中所有的样品和所用到的缓冲液都要经过0.22um的膜过滤除菌。
4.根据权利要求2所述的微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法,其特征在于,所述步骤(1)中的茂源链霉菌编号为CGMCCNo.10804。
5.根据权利要求2所述的微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法,其特征在于,所述步骤(2)中的平衡缓冲液为pH6.5...

【专利技术属性】
技术研发人员:金明飞常忠义高红亮易正芳王志珍沈迎辉陈旭宋佳雯步国建
申请(专利权)人:华东师范大学泰兴市东圣食品科技有限公司
类型:发明
国别省市:上海;31

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