荧光或者吸光度的检测方法、背景抑制方法、ADP的测定方法、生成ADP的酶的活性测定方法、以及糖基转移酶的活性测定方法技术

本发明专利技术的荧光或者吸光度的检测方法的特征在于，在SH试剂以及NADH或者NADPH的存在下，通过心肌黄酶将刃天青还原为试卤灵，测定产生的荧光强度或者吸光度。本发明专利技术的ADP的测定方法的特征在于，具有：使ADP以及ADP依赖性己糖激酶作用于葡萄糖的第2‑1工序；使NAD或者NADP以及葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶作用于通过所述第2‑1工序得到的葡萄糖‑6‑磷酸的第2‑2工序；以及，在SH试剂存在下，使通过所述第2‑2工序得到的NADH或者NADPH、以及心肌黄酶作用于刃天青，测定产生的荧光强度或者吸光度的第2‑3工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能高灵敏度地测定进行从刃天青至试卤灵的还原而产生的荧光强度或吸光度的荧光或者吸光度的检测方法、背景抑制方法、ADP的测定方法、简便并且高灵敏度地测定激酶等ADP生成酶或者糖基转移酶的活性的方法、使用所述方法的糖基转移酶或者激酶等ADP生成酶的活性调节剂的筛选方法、以及用于所述方法的测定试剂盒。本申请主张基于2013年11月21日在日本提出的专利申请特愿2013-240926号的优先权，在此援用其内容。
技术介绍
糖基转移酶是催化从含有糖基的供体(G)向受体(A)转移糖基而产生G-A的反应的酶的总称(非专利文献1)。在动物中，9种糖核苷酸(GDP-岩藻糖、GDP-甘露糖、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-木糖、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖、UDP-N-乙酰氨基半乳糖、CMP-唾液酸)为主要的供体分子(非专利文献2)。使糖基从这些供体分子转移的糖基转移酶分别称作岩藻糖基转移酶、甘露糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖醛酸基转移酶、木糖基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、N-乙酰氨基半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶。GDP是鸟苷5’-二磷酸的略称，UDP是尿苷5’-二磷酸的略称，CMP是胞苷5’-单磷酸的略称。作为受体分子，可举例单糖、寡糖、蛋白质、脂质、糖蛋白质、糖脂质等。已知在生物分子的功能表达中，糖链发挥重要的作用，已明确糖基转移酶的活性异常与癌症、传染病、免疫疾病、炎症、神经疾病等疾病相关(非专利文献3)。因此，期待糖基转移酶的活性调节剂(抑制剂或活性化剂)成为所述疾病的新的治疗药物。对于探索糖基转移酶的活性调节剂而言，必须测定糖基转移酶的活性。作为测定糖基转移酶的活性的方法，以往，采用使用放射性标识、荧光标识的糖分子进行分析的方法、使用非标识糖分子在反应后通过LC-MS(液相色谱-质谱分析机)等仪器分析进行分离定量的方法等(非专利文献4)。但是，上述方法需要标识糖供体的化学合成，测定需要特殊的装置(液体闪烁器、LC-MS)，并且难以进行简单的分析，尤其是难以使用微孔板进行大量的数量分析(高通量筛选)。另外，在费用上是耗费成本的方法。另一方面，已知有使用市售的分析试剂盒(贝尔布鲁克实验室(BellbrookLabs)公司制造的Transcreener(注册商标)GDPAssay、UDP2Assay、AMP2/GMP2Assay)通过荧光偏光法对通过糖基转移酶反应生成的核苷酸进行定量的方法、通过酶偶联反应获得NADH的吸光度进行测定的方法(非专利文献5、6)、或者使磷酸游离而通过孔雀绿的发色进行定量的方法(非专利文献7)，但是检测灵敏度都较低。另外，还已知有通过酶偶联诱导荧光素酶的化学发光进行测定的方法(专利文献1)，但是操作繁杂，灵敏度不明确。另外，最近，报告了使用荧光偏光法对通过荧光标识的糖的转移进行高速的分析的方法(非专利文献8)，但只能使用于高分子性的底物，并非能应用于所有的糖基转移酶。如此地，现有的方法难以使用微孔板简便且高灵敏度地分析所有的糖基转移酶，难以进行糖基转移酶活性调节剂的高通量筛选。另一方面，激酶是将ATP(腺苷5’-三磷酸)等核苷三磷酸的末端磷酸基转移至除水以外的化合物，催化生成磷酸化合物的反应的酶的总称，被分类为EC2.7组的磷酸转移酶(非专利文献9)。作为被磷酸化的底物分子，可举例糖、有机酸、脂质、蛋白质等。激酶是与生物体内的信号传达有关的重要的酶分子。已知在某种癌细胞中，激酶活性亢进，激酶的抑制剂作为所谓的分子靶向药物被用于癌症的治疗。另外，已知激酶与炎症、免疫反应、糖尿病等也有关。因此，激酶是针对癌症、炎症、自身免疫疾病、糖尿病等疾病的治疗药物开发的合适的靶分子，正在广泛进行其新抑制剂的探索研究(非专利文献10)。在对激酶活性调节剂(抑制剂或者活性化剂)的探索中，必须测定激酶的活性。作为激酶活性的测定方法，作为主要的方法可举例对被磷酸化的生成物进行定量的方法、测定ATP的减少量的方法、对从ATP生成的ADP(腺苷5’-二磷酸)进行定量的方法。作为对被磷酸化的生成物进行定量的方法，可举例通过放射能计数测定从放射性ATP生成的放射性生成物的方法、通过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)对被磷酸化的生成物进行定量的方法、用抗体检测被磷酸化的生成物并通过时间分解荧光法等进行分光学定量的方法(例如，卡纳生物科学(CarnaBiosciences)公司制造的QSSAssist(商标)TR-FRET分析试剂盒)等。作为测定ATP的减少量的方法，可举例使用荧光素酶通过化学发光对激酶反应液中的残存ATP量进行定量的方法(例如，东洋比网公司(東洋ビーネット社)制造的《细胞的》ATP测定试剂(『細胞の』ATP測定試薬，商标))。作为对从ATP生成的ADP进行定量的方法，可举例：1)再变换为ATP与荧光素酶反应，通过化学发光进行定量的方法(例如，普洛麦格(Promega)公司制造的ADP-Glo(商标)激酶分析(KinaseAssay))；2)使用抗ADP抗体通过时间分解荧光法或荧光偏光法进行分光学定量的方法(例如，贝尔布鲁克实验室(BellBrookLabs)公司制造的Transcreener(注册商标)ADPTR-FRETAssay、Transcreener(注册商标)ADPAssay)；3)使磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶作用于ADP，进一步使10-乙酰基-3,7-二羟基吩恶嗪和过氧化物酶作用于生成的过氧化氢，进行荧光测定的方法(例如，DiscoveRx公司制造的ADPHunter(商标)HSAssay)；4)使葡萄糖、ADP依赖性己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(以下，称为G-6-P脱氢酶)作用于ADP，生成NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，通过NADPH的吸光度或荧光进行定量的方法(专利文献2～3)；5)使葡萄糖、ADP依赖性己糖激酶、G-6-P脱氢酶、NADP、心肌黄酶、刃天青作用于ADP，通过生成的试卤灵的荧光进行定量的方法(专利文献4)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2005-46029号公报；专利文献2：日本特开平9-234098号公报；专利文献3：日本特开2011-103825号公报；专利文献4：美国专利第7338775号公报说明书。非专利文献...

【技术保护点】
一种荧光或者吸光度的检测方法，其特征在于，在SH试剂以及NADH的存在下或者在SH试剂以及NADPH的存在下，通过心肌黄酶将刃天青还原为试卤灵，测定产生的荧光强度或者吸光度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.21 JP 2013-2409261.一种荧光或者吸光度的检测方法，其特征在于，在SH试剂以及NADH
的存在下或者在SH试剂以及NADPH的存在下，通过心肌黄酶将刃天青还
原为试卤灵，测定产生的荧光强度或者吸光度。
2.如权利要求1所述的荧光或者吸光度的检测方法，其中，所述SH试
剂是用下述通式[1]表示的马来酰亚胺化合物或者2-碘乙酰胺，
在通式[1]中，
R1表示氢原子、羟基、具有取代基或不具有取代基的碳原子数为1～6的
直链状或者支链状的烷基、具有取代基或不具有取代基的碳原子数为1～6的
直链状或者支链状的烷氧基、具有取代基或不具有取代基的碳原子数为1～6
的直链状或者支链状的羟基烷基、具有取代基或不具有取代基的碳原子数为
1～6的直链状或者支链状的磺基烷基、或者具有取代基或不具有取代基的碳
原子数为6～10的芳基；
R2表示氢原子、羟基、卤原子、具有取代基或不具有取代基的碳原子数
为1～6的直链状或者支链状的烷基、具有取代基或不具有取代基的碳原子数
为1～6的直链状或者支链状的烷氧基、具有取代基或不具有取代基的碳原子
数为1～6的直链状或者支链状的羟基烷基、或者具有取代基或不具有取代基
的碳原子数为1～6的直链状或者支链状的磺基烷基；
n表示R2的数量，为0或者1。
3.一种背景抑制方法，其特征在于，在还原剂的共存下，在测定使NADH、
刃天青、以及心肌黄酶反应而产生的荧光强度或者吸光度时或者在测定使
NADPH、刃天青、以及心肌黄酶反应而产生的荧光强度或者吸光度时，在
SH试剂的存在下进行前述反应。
4.如权利要去3所述的背景抑制方法，其中，所述SH试剂是用下述通
式[1]表示的马来酰亚胺化合物或者2-碘乙酰胺。
在通式[1]中，R1、R2、以及n表示与上述相同的含义。
5.一种ADP的测定方法，其特征在于，其具有：
第2-1工序，该工序使ADP以及ADP依赖性己糖激酶作用于葡萄糖，
生成葡萄糖-6-磷酸；
第2-2工序，该工序使NAD和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或者NADP和葡萄
糖-6-磷酸脱氢酶作用于通过前述第2-1工序得到的葡萄糖-6-磷酸，生成
NADH或者NADPH；以及，
第2-3工序，该工序在SH试剂存在下，使通过前述第2-2工序得到的
NADH或者NADPH、以及心肌黄酶作用于刃天青，测定产生的荧光强度或
者吸光度。
6.如权利要求5所述的ADP的测定方法，其中，所述SH试剂是用下述
通式[1]表示的马来酰亚胺化合物或者2-碘乙酰胺，
在通式[1]中，R1、R2、以及n表示与上述相同的含义。
7.如权利要求5所述的ADP的测定方法，其中，用前述通式[1]表示的
马来酰亚胺化合物是N-乙基马来酰亚胺、马来酰亚胺、或者N-(2-磺基乙基)
马来酰亚胺。
8.一种生成ADP的酶的活性测定方法，其特征在于，其具有：
第1-1工序，该工序在ATP的存在下，使生成ADP的酶作用于底物，
使ATP变换为ADP；
第2-1工序，该工序使通过前述第1-1工序得到的ADP以及ADP依赖性
己糖激酶作用于葡萄糖，生成葡萄糖-6-磷酸；
第2-2工序，该工序使NAD和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或者NADP和葡萄
糖-6-磷酸脱氢酶作用于通过前述第2-1工序得到的葡萄糖-6-磷酸，生成
NADH或者NADPH；以及，
第2-3工序，该工序在SH试剂的存在下，使通过前述第2-2工序得到的

\tNADH或者NADPH、以及心肌黄酶作用于刃天青，测定生成的荧光强度或
者吸光度。
9.如权利要求8所述的生成ADP的酶的活性测定方法，其中，所述SH
试剂是用下述通式[1]表示的马来酰亚胺化合物或者2-碘乙酰胺，
在通式[1]中，R1、R2、以及n表示与上述相同的含义。
10.如权利要求8所述的生成ADP的酶的活性测定方法，其中，用所述
通式[1]表示的马来酰亚胺化合物是N-乙基马来酰亚胺、马来酰亚胺、或者
N-(2-磺基乙基)马来酰亚胺。
11.如权利要求8所述的生成ADP的酶的活性测定方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊谷和夫，冈部隆义，小岛宏建，长野哲雄，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP