本发明专利技术公开了一种新的血清代谢物的组合及其作为标志物在制备早期肝癌诊断试剂盒中的用途。所述血清代谢物组合包括：甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16∶1和苯丙氨酰色氨酸，该血清代谢物的组合可用于肝癌的早期诊断，具有检测成本低，重复性和诊断灵敏度高的特点，并与传统的临床诊断标志物血清甲胎蛋白(AFP)具有良好的互补性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的组合标志物在制备早期肝癌诊断试剂盒中的应用。属于分析化学及临床医学领域。
技术介绍
肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是指发生于肝脏的恶性肿瘤，据统计每年肝癌新发患者约60万，其发病率居恶性肿瘤的第五位，致死率居第三位。肝癌的病因复杂，大部分是由于肝炎病毒感染引起的，在我国肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来。肝癌由于其早期症状不明显难以被发现，而对于中晚期肝癌又缺乏有效的治疗，其5年存活率为7％，而到IV阶段仅为3.9％，因此早发现、早治疗对肝癌极其重要。目前，肝癌的诊断主要有影像学检查和血清甲胎蛋白(AFP)检测，但是前者检查作用有限，往往到了中、晚期才能够发现和确诊，缺少预警价值；后者其诊断的敏感性和特异性较低，检出率一般只有50％-75％左右。因此，为了提高肝癌早期临床诊断的灵敏度和特异性，开发新的诊断方法势在必行。有研究表明肝癌的发生和发展与多种小分子代谢紊乱密切相关，例如：氨基酸代谢，脂质代谢，胆汁酸代谢等等。本专利技术首次发现血清中的甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸苯丙氨酰色氨酸可以作为一种新的肝癌标志物组合，并采用步进式判别法(见图1)，用于辅助诊断早期肝癌。甘氨胆酸是种甘氨酸结合型胆汁酸的胆汁，胆汁酸是一种类固醇酸，由胆固醇在肝脏中合成，可加速脂肪的代谢和脂溶性的维生素和固醇类的吸收，同时它也被认为是一种多功能的重要信号分子，在能量动态平衡、磷脂代谢、糖代谢以及细胞增殖或凋亡等整合调节中起重要调节作用[1]。胆碱是卵磷脂的基本组成部分，它是乙酰胆碱的合成前体，同时也是很多代谢过程中的甲基供体(如脂质代谢)，目前它也被认为是一个重要的维生素，涉及到脂质代谢和葡萄糖体内平衡调节[2、3]；色氨酸是人体中常见的必需氨基酸和生糖氨基酸，有研究报道肿瘤患者中色氨酸代谢异常，可能是由于机体对恶性肿瘤做出抵抗性免疫应答或者是恶性肿瘤的免疫逃逸机制导致色氨酸的损耗[4、5]；组氨酸是一种蛋白氨基酸，在机体中组氨酸利用其咪唑环具有清除活性氧的特性来保护有炎症的组织和器官，具有抗氧化，抗炎和氧化应激的特性[6]；尿苷涉及到嘧啶代谢；苯甲酰胺是苯甲酸降解的中间物；溶血磷脂酰胆碱类代谢物对病理生理学的刺激非常灵敏，在细胞增殖、肿瘤细胞入侵和促炎、抗炎[7、8]等生理过程起着重要调控作用。鉴于此，测定血清中以上8种小分子代谢物的含量变化情况有利于了解肝细胞的代谢变化，以便辅助诊断早期肝癌。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服肝癌早期隐蔽性强而诊断难的问题，提供一种新的血清代谢物组合，该代谢物组合可作为标志物应用于肝癌的早期诊断。本专利技术首次公开了一种能够用于肝癌早期诊断的血清代谢物的组合，该组合包括甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸8种血清小分子。优选地，所述组合由甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸这8种血清小分子组成。换言之，本专利技术提供一种用于肝癌早期诊断的组合的标志物，其包括甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸8种血清小分子，优选地，其由甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸这8种血清小分子组成。该组合的质谱靶向分析离子信息如表1所示。表1.8种组合标志物的靶向分析的信息表根据上述小分子代谢物的组合，采用步进式判别法(见图1)，以逻辑回归公式可应用于早期肝癌的诊断，包括对肝癌、肝硬化患者与健康人进行区分以及对肝癌及肝硬化患者进行判别。本专利技术还涉及甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸的血清代谢物组合在制备早期肝癌诊断试剂盒中的应用。本专利技术还提供一种早期肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测血液样品中权利要求1所述的每种血清代谢物的浓度的试剂和内标。其中所述内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC19：0和D3-脂肪酸18：0。根据上述血清代谢物组合标志物的试剂盒采用基于液相色谱质谱联用的靶向方法检测，试剂盒中包含的提取溶剂内标及其浓度见表2。表2.提取剂中内标及其浓度根据该试剂盒的检测方法如下：a)血清样本预处理方法：血样在4℃下解冻，取80μL血清样本，加入320μL含有试剂盒内标的乙腈提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000rpm转速离心10-15mins，取上清冷冻干燥。b)目标代谢物靶向检测方法如下：分离系统为Waters超高效液相色谱仪，流动相流速为0.35ml/min，柱温为50℃，进样量为5ul；正离子模式：色谱柱为C8柱，洗脱液A相为0.1％(v/v)甲酸的水溶液、B相为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；负离子模式：色谱柱为T3柱，流动相A为含5mM的碳酸氢铵水溶液，B相为含5mM的碳酸氢铵的甲醇溶液；检测器为适合定量分析的单四极杆质谱或串联四级杆质谱仪。待检测的离子对及其相关的碰撞电压见表1。c)基于质谱检测数据的判断模型：首先，基于正常对照组和肝病组(肝硬化和肝癌组)数据建立了判别正常人和肝病组的模型I；回归方程如下式1：模型IX＝9.876-0.509*A+2.339*B-0.482*H-0.454*G-0.566*EProb(肝病)＝1/(1+e-X)(截点值(Cutoff)＝0.5)(式1)其次基于肝硬化组和肝癌组数据建立了判别肝硬化组和肝癌组的模型II，回归方程如下式2：模型IIX’＝7.709-0.413*A-1.803*B-0.118*C-10.983*D-1.455*FProb’(肝癌)＝1/(1+e-X’)(截点值(Cutoff)＝0.5)(式2)其中A、B、C、D、E、F、G、H分别为苯丙氨酰色氨酸、甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、胆碱、尿苷、溶血磷脂酰胆碱16：1、和组氨酸的在取自受试者的血清样品中的浓度值(ug/ml)，Prob(肝病)表示诊断为肝病的概率，截点值(Cutoff)＝0.5，即当Prob(肝病)值大于0.5时，诊断所述受试者患有肝病；Prob’(肝癌)表示诊断为肝癌的概率，截点＝0.5，即当Prob’(肝癌)值大于0.5时，诊断所述受试者患有肝癌。由此，本专利技术提供一种诊断受试者中的早期肝癌的方法，所述方法包括：(1)从所述受试者采集血液样品，提取血清，加入内标，利用质谱法定量血清样品中的甘氨胆酸、组氨酸、胆碱、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸的浓度值，单位为ug/ml，利用逻辑回归判别公式1计算所述受试者患有肝病的可能性：逻辑回归判别公式1：Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸浓度值+本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够用于肝癌早期诊断的新的血清代谢物的组合，其包含下述血清代谢物：甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16:1和苯丙氨酰色氨酸。
【技术特征摘要】
1.一种能够用于肝癌早期诊断的新的血清代谢物的组合，其包含下述
血清代谢物：甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血
磷脂酰胆碱16:1和苯丙氨酰色氨酸。
2.权利要求1所述的血清代谢物的组合在制备早期肝癌诊断试剂盒
中的用途，其中所述试剂盒包含血清样品提取溶液和检测所述血清代谢物
的浓度所需要的内标，其中诊断步骤包括：
(1)通过检测血清样品中甘氨胆酸、组氨酸、胆碱、溶血磷脂酰胆
碱16:1和苯丙氨酰色氨酸的浓度来诊断受试者是否患有肝病，并且
(2)通过检测步骤(1)中被诊断为患有肝病的受试者的血清样品中
甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的浓度来确定所述
受试者是否是肝癌患者。
3.根据权利要求2所述的用途，其中检测权利要求1所述的各种血清
代谢物的内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC19:
0和D3-脂肪酸18:0。
4.根据权利要求2所述的用途，其中步骤(1)区分肝病患者和健康
受试者的逻辑回归判别公式1为：
Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，
其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸浓度值+2.339×甘氨胆酸浓度值
-0.482×组...
【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，罗萍，尹沛源，孔宏伟，李艳丽，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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