一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种杜仲几丁质酶编码基因(EuCHIT1)及其应用，属于生物工程技术领域。根据杜仲转录组数据库注释几丁质酶基因部分片段，通过SMART RACE技术，从杜仲中克隆丁质酶基因如SEQ ID NO:1所示，其基因序列和翻译氨基酸如SEQIDNO:2所示。在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上,遗传转化烟草，通过对烟草总蛋白的提取进行体外抑菌试验发现，其对镰刀菌和灰霉菌有明显的抑制效果。本发明专利技术为进一步利用生物工程技术将外源几丁质酶基因转入各种植物中，从而提高植物抗真菌能力，培育抗病品种提供基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
,主要关于杜仲抗真菌几丁质酶(EuCHIT1)及编码基因与应用。
技术介绍
杜仲(EucommiaulmoidesOliver)是杜仲科杜仲属植物雌雄异株，在我国被利用的历史可以追溯到公元二世纪的《神农本草经》，具有双向调节血压、抑菌和抗菌效用，具有重要的药用价值。鉴于其起源古老，在科学上具有重要的研究价值，目前对杜仲的研究主要集中在血压调节物质，杜仲胶合成途径相关基因的克隆和抗菌物质的化学分离方面。早期研究表明从杜仲中提取的总蛋白对多种植物病源真菌的生长具有明显的抑制作用，并且从中分离到的杜仲抗菌肽EAFP1和EAFP2含有几丁质结合结构。几丁质酶广泛的存在于动植物及微生物的细胞和组织中，以几丁质为底物将其水解成寡聚糖再进一步水解为N－乙酰氨基葡萄糖，高等植物不含作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到真菌、细菌和病毒等感染时，植物几丁质酶的转录表达量迅速提高。因此普遍认为几丁质酶是植物重要的病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein，PR)。目前多种植物的几丁质酶基因序列被克隆，如白杨、蚕豆、小麦、水稻、甜菜、烟草、马铃薯、棉花等，但对杜仲几丁质酶基因的研究尚未见报导
技术实现思路
针对上述领域中的空白，本专利技术提供一种杜仲几丁质酶，对植物真菌病害的防治有明显的作用。本专利技术的目的之一是提供一种杜仲几丁质酶。本专利技术另一目的是提供编码上述杜仲几丁质酶的基因序列。本专利技术另一目的是提供上述杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。杜仲几丁质酶(EuCHIT1)，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。编码上述杜仲几丁质酶的基因。所述编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDNO：1所示。杜仲几丁质酶的表达载体，含有编码上述杜仲几丁质酶的基因。所述表达载体的骨架载体为pSH-35S。杜仲几丁质酶的生产方法，将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使其表达杜仲几丁质酶，利用生物反应器生产杜仲几丁质酶，再提取得到。所述转化为将上述表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404，遗传转化烟草。杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。所述应用为将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使植物表达对真菌病害的抗性；或者所述应用为将杜仲几丁质酶作为药效成分制成药剂用于防治真菌病害。所述真菌为镰刀菌或灰霉菌。本专利技术提供一种杜仲几丁质酶及其编码基因与应用，根据已经构建的杜仲转录组注释的几丁质酶基因部分序列,设计RACE扩增引物，提取杜仲的总mRNA反转cDNA为模板，扩增基因的5’端和3’端序列，经过overlap拼接获得全基因序列，根据拼接结果设计开放阅扩增引物。开放阅读框编码的氨基酸序列，经过NCBI同源比对后发现与刺槐的几丁质酶的同源性为84％。在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上，构建植物表达载体遗传转化烟草。提取烟草总蛋白进行抑菌试验发现与野生型烟草相比，该转基因烟草对镰刀菌这一植物病原真菌的生长具有抑制作用，故该基因可以用于对植物真菌病害的防治中。附图说明图1是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶基因5’-RACE和3’-RACEPCR产物电泳图；图2是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶几丁质结合和催化位点预测图；图3是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶磷酸化位点预测图；图4是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶信号肽预测图；图5是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶进化树分析图；图6是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶基因开放阅读框PCR扩增图；图7是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶遗传转化烟草过程图；图8是本专利技术实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图(镰刀菌)；图9是本专利技术实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图(灰霉菌)。具体实施方式为了更为清楚的解释本专利技术的目的和技术方案以及优点，结合附图对本专利技术进一步详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅仅用以解释本专利技术。本实验使用贵州农业生物工程重点实验室试验示范基地种植10余年生杜仲为材料，采集雌雄株幼芽、叶片、幼枝、树皮及雌株幼果提取总RNA，反转cDNA。总RNA的提取采用omega公司的PlantRNAKit的困难样本说明进行，提取样本经无水乙醇洗涤2次去除多余的盐分，最終提取产物溶于适量的40ulRnase-free水中，-80℃保存。5’-和3’-RACE-ReadycDNA的制备方法参照SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit说明书制备。1)3’端和5’端RACE扩增根据己构建的杜仲转录组文库中已有的杜仲几丁质酶的部分序列，经过NCBI数据库blastp比对后选取与其它植物几丁质酶同源性较高的序列作为overlap，设计5’-和3’-RACE扩增的引物，引物的各项参数符合SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit的各项要求，引物质量评估使用DNAStar7.10，引物序列为：EuCHIT1GSP1:5’CCTGGATTCGGTACCACTATGAATGTCCC3’；EuCHIT1GSP2:5’GCTTGGGTTGAAAGGAAGCTGCTCG3’几丁质酶基因RACEPCR扩增体系及程序:PCR管中建立50μL反应体系，依次加入下列成分:34.5μLPCR-GradeWater；5.0μL10×Advantage2PCRBuffer；1.0μldNTPMix(10mM)；1.0μl50XAdvantage2PolymeraseMix混匀切勿产生气泡。继续加入2.5μL5’(3’)-RACE-ReadycDNA，5μL10×UPM，1μLGSP2(GSP1)，终体积50μL。混匀后按下列程序进行PCR扩增:94℃、30s；72℃、2min、5cycles；94℃、30s；70℃、30s；72℃、2min，5cycles；94℃，30s，68℃，30s，72℃，2min，25cycles。取4μL产物凝胶电泳检测，扩增结果如图1所示。开放阅读框预测及序列分析。50ulPCR产物1％的琼脂糖凝胶(BIOWESTREGULARAGAROSEG-10)电泳。E.Z.N.A.GelExtractionKit切胶回收纯化，获得片段连接至pGEM-TEasyVector(PromegaCorporation)载体上，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)。以氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chlo本文档来自技高网...

【技术保护点】
杜仲几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
2015.12.01 CN 20151086205431.杜仲几丁质酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
2.编码权利要求1所述的杜仲几丁质酶的基因。
3.权利要求2所述的编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDNO：1所示。
4.杜仲几丁质酶的表达载体，含有权利要求2或3所述的编码杜仲几丁质酶的基因。
5.权利要求4所述的杜仲几丁质酶的表达载体，所述表达载体的骨架载体为pSH-35S，
所述的编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDNO：1所示。
6.杜仲几丁质酶的生产方法，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵德刚，董璇，郭林霞，李岩，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52