本申请提供了具有5’末端和3’末端的单链寡核苷酸，所述寡核苷酸包含第一区段和第二区段，第一区段位于第二区段的5’；并且其中(i)第一区段用至少两个可检测标记物标记并且能够与靶多核苷酸杂交；并且(ii)第二区段不能与靶多核苷酸杂交；所述第二区段包含含有第一部分、第二部分和第三部分的茎环结构，并且其中第二部分位于第一部分和第三部分之间，第一部分和第三部分彼此互补。本申请还提供了使用此寡核苷酸检测靶多核苷酸的存在和/或靶多核苷酸内部序列变异的存在的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及寡核巧酸，并尤其设及它们作为探针在使用可检测标记物(例如目视 可检测的标记物)检测杂交事件和检测和/或区分核酸中的用途。
技术介绍
基于用可检测标记物(例如巧光团)标记的寡核巧酸的探针技术，尤其W巧光团作 为5'憐酸末端处添加物的探针技术已经建立已久。运种末端标记价廉，并且因此运类探针 的开发和应用广泛遍及各种分子生物学应用。相比之下，其中多个巧光团可W与寡核巧酸 序列内部的核巧碱基或糖连接（即内部标记）的优化探针设计，例如HyBeacon探针(French et al，（2001)、W0 01/73118、W0 07/010268)应用并不广泛，原因在于运类内部巧光团添加 本身更为昂贵。在末端标记的寡核巧酸中，通常还需要存在单独的泽灭物分子，W防止在寡 核巧酸与祀多核巧酸杂交前的信号。内部标记的寡核巧酸（例如W0 01/73118、W0 07/ 010268中描述的那些)通常不需要单独泽灭物的存在，原因是寡核巧酸探针的单链序列作 为标记物的泽灭物(DNA泽灭)而发挥作用。 建立已久的使用标记核酸寡核巧酸作为祀核酸序列（DNA或RNA)存在的报道分子 的领域利用了基于寡核巧酸的探针与其祀核酸序列的直接核巧酸序列互补性，W及其与基 因组背景相比足够的共有序列所实现的唯一匹配。 寡核巧酸与核酸序列的杂交消除了 DNA泽灭和染料-染料相互作用，并且引起巧光 发射的增加(W0 01/73118、W0 07/010268)。巧光发射的变化使得可W检测特异的核酸序 列，探针和祀之间相互作用的稳定性，使得可W基于长度和序列区分多态性序列（French et al.2001,Rrench et al.2002,Rrench et al.2007,Rrench et al.2008)。 除非需要获得与探针-祀相互作用并存的特定的额外分子端点，否则没必要刻意 使用部分序列互补性或使用在探针及其祀之间提供媒介杂交事件的额外寡核巧酸。 在巧光寡核巧酸探针的例子中，常规探针-祀杂交配对中发现的直接序列互补性 的重要增量收益在于，祀中的任何序列变异(如单核巧酸多态性(SNP))直接破坏了运种杂 交并且因此直接破坏了探针的巧光输出。 主要地，已知寡核巧酸探针中的DNA茎环序列可用于信号生成和祀检测，从而使得 在寡核巧酸与祀多核巧酸杂交时，茎环结构消失（即寡核巧酸不再具有二级结构）。[000引"分子信标"是形成茎环结构的单链寡核巧酸（Tyagi&Kramer，1996 ;Tyagi et al. 1998)。茎包括位于探测序列任一侧的两条互补的核酸序列。茎序列之一通常用巧光团 标记，另一条通常用非巧光泽灭物标记。茎环结构使巧光团和泽灭物部分紧密靠近，从而充 分泽灭巧光发射。分子信标寡核巧酸的环组件与祀核酸互补，并且杂交引起茎环解离，原因 是分子间的探针/祀杂交比寡核巧酸茎序列之间的分子内相互作用更稳定。巧光团和泽灭 标记物在探针杂交时由于茎环结构的解离而分离，运导致信号发射增加。分子信标寡核巧 酸可用于实时PCR和解链曲线分析。 与分子信标类似，Knemeyer et al. (2000)描述了运样的寡核巧酸（Sma;rt探针 (Smad probes))，所述寡核巧酸具有茎环结构，但却通过光诱导的分子内电子转移至一条 寡核巧酸茎序列内的鸟嚷岭残基而实现了巧光泽灭。连接在一条寡核巧酸茎序列末端的巧 光团（例如嗯嗦染料JA242)与发夹的互补茎序列中的富含G序列紧密靠近。探针与祀序列的 杂交将巧光团与富含G序列分开，从而导致巧光增强。 Scorpion?引物包含位于茎环结构内部的探测序列，其具有位于探测序列任一侧 的互补茎序列(怖itcombe et al.l999;Thelwell et al.2000)。连接至寡核巧酸5'末端的 巧光团部分被连接至茎环的3'末端的内部泽灭物修饰所泽灭。茎环序列通过PCR制止物(例 如六乙二醇化EG))而与PCR引物的5'末端连接。引物组件的延伸产生了用于寡核巧酸的探 测组件的祀序列。与所扩增的祀的分子内探针杂交引起了茎环结构的解离W及巧光发射的 增加。 分子信标、Smad探针和Scorpion?引物利用了具有位于探测序列的两个末端的茎 序列的发夹结构。环与祀多核巧酸结合，但茎序列不与祀相互作用。 Satterfield et al. (2007)和US2009/0305264描述了具有类似于分子信标(其中 巧光团和泽灭物部分在发夹内紧密靠近)且通过连接子与捕获探针序列连接的茎环序列的 寡核巧酸(Tentacle探针?)。捕获探针组件与祀序列结合，并使茎环组件与下游祀紧密靠 近。然后，发夹的探针序列与祀序列结合，从而将巧光团和泽灭标记物分开，并增加巧光发 射。据报道，捕获探针序列的加入改善了杂交的动力学。 W0 2010/101947也描述了用于检测核酸序列的茎环寡核巧酸（也是tentacle探 针?的形式）。在不存在祀的情况下（用于染料泽灭或FRET)，发夹结构在5'或3'末端形成，从 而使两个标记物紧密靠近。寡核巧酸末端之一(5'或3'）与探针序列的内部区域互补，发夹 的环与核酸祀互补。另一个寡核巧酸末端(3'或5'）的延伸超出发夹，从而引发祀杂交并帮 助茎环结构内探测序列的杂交。发夹之外的额外的探测序列改善了杂交的动力学。祀杂交 引起寡核巧酸标记物分离，用于去除巧光泽灭或FRET相互作用。 化zarenko et al.(1997)描述了具有连接到引物的5'末端的茎环结构的寡核巧 酸(Sunri Se引物或Amp 1 if 1 uor?)。巧光团连接到寡核巧酸的5 '末端，泽灭物的位置接近引 物的3'末端。茎环结构的形成使巧光团和泽灭物部分在茎上紧密靠近，从而引起高效的巧 光泽灭。PCR扩增使Sunrise引物被引入到扩增产物中，阻止了茎环结构的形成，并引起巧光 团和泽灭物部分的分离。巧光发射在扩增的祀序列存在下增加。然而，由引物二聚体产生的 非特异性扩增也可W导致巧光发射增加。 化zarenko et al.(2002)描述了用位置临近引物3'末端的单个巧光团标记的寡 核巧酸化UX引物?Κ5-7个核巧酸的序列位于寡核巧酸的5'末端，其与引物的3'末端互补， 从而产生发夹。寡核巧酸不包含泽灭物修饰，但是在发夹中使用DNA泽灭，从而在无祀时降 低信号发射。PCR扩增导致寡核巧酸被引入到扩增产物中，运阻止了茎环结构的形成，并且 去除了发夹施加的DNA泽灭。 Tentacle探针?、sunrise引物和LUX引物?全部使用茎环序列，用于通过使用发夹 结构使两个标记物(或一个标记和泽灭核巧酸序列)在无祀时紧密靠近而检测祀。探针和祀 核酸的杂交导致寡核巧酸标记物分开，从而可W测定改变的巧光发射。在每种情况下，祀特 异性核巧酸序列均被引入到发夹结构中。 US 2007/0015176教导了具有变化的二级结构且每一种二级结构均包含至少一个 茎环结构的检测探针。US 2007/0015176的检测探针均要求具有含两个独立寡核巧酸的双 链核巧酸结构。 US 2006/0216692描述了用巧光标记物和泽灭物分子两者标记的核酸构建体。标 记的寡核巧酸包含至少一个茎本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有5’末端和3’末端的单链寡核苷酸，所述寡核苷酸包含第一区段和第二区段，第一区段位于第二区段的5’，其中：(i)第一区段用至少两个可检测标记物标记并且能够与靶多核苷酸杂交；并且(ii)第二区段不能与靶多核苷酸杂交；所述第二区段包含含有第一部分、第二部分和第三部分的茎环结构，并且其中第二部分位于第一部分和第三部分之间，第一部分和第三部分彼此互补，其中，所述茎环结构没有用可检测的标记物标记；并且，进一步地，其中，在用于检测靶多核苷酸的方法中时，所述寡核苷酸(a)不被3’‑5’核酸外切酶切割且(b)不被聚合酶延伸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·弗伦奇，保罗·德贝纳姆，
申请(专利权)人：LGC有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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