高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶、其编码基因及其制备方法技术

技术编号:13254177 阅读:92 留言:0更新日期:2016-05-15 17:56
本发明专利技术公开了一种高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶及其制备方法和应用,其氨基酸编码序列如SEQ ID NO.2所示,共542个氨基酸,其理论分子量为61.85kDa。本发明专利技术提供的高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶(XylRBM26)有β-D-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性,能够在高木糖环境下保持较高的活性(Ki值500mM),其最适pH为6.5,最适温度为50℃;在45℃条件下耐受60min,仍能保持95%以上活性,能将木二糖、木三糖、木四糖彻底水解成木糖。该酶可做为一种新型的酶制剂,可广泛用于食品、饲料、能源工业等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
,尤其设及一种高木糖耐受性双功能半纤维素降解 酶、其编码基因及其制备方法。
技术介绍
木聚糖为植物半纤维素的主要组分,木糖是其完全降解的终产物,完成整个水解 过程需要木聚糖酶系的协同作用。木聚糖酶主要包括:内切1,4-β-Ο-木聚糖酶(endo-1,4- β-D-xylanohy化olase,EC 3.2.1.8),它主要是随机切割木聚糖的主链生成不同长度的木 寡糖;0-木糖巧酶(0-D-xylosidase,EC 3.2.1.37),作用于低聚糖和木二糖使其最终降解 为木糖;而a-D-葡萄糖醒酸巧酶(a-D-gluca化onidase,EC 3.2.1.139)、乙酷木聚糖醋酶 (acetylxylan esterase,EC 3. 1.1.72)、a-l^-阿拉伯巧喃糖巧酶(日-1^- arabinofuranosidase,EC 3.2. 1.55)、阿魏酸醋酶(ferulic acid esterase,EC 3.1.1.73)等酶在去除侧链取代基团发挥作用。通过运些酶的协同作用,木聚糖能够有效地 被水解(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3-23)。 β-木糖巧酶在整个协同水解过程中可W降低木聚糖的水解产物从而可W较大程 度的解除产物对木聚糖酶的抑制,是木聚糖水解过程中的限速酶。αΑ-阿拉伯巧喃糖巧酶 可W催化水解^〇-1,3、〇-1,2或〇-1,5键连在木糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚体侧枝。研 究表明,αΑ-阿拉伯巧喃糖巧酶与木聚糖酶和木糖巧酶等存在协同作用能促进木聚糖的降 解。有些木聚糖主链在侧链没有降解前,其糖巧键无法被木聚糖酶完全水解。另一方面,一 些只能降解侧链的辅助酶,需要在木聚糖主链部分水解后才能发挥作用(Dumbrepatil et al.J Microbiol Biotechnol,2012,12:1724-1730)。 木糖是β-木糖巧酶的一种强抑制剂,β-木糖巧酶将低聚木聚糖降解为木糖或协助 木聚糖酶将木聚糖降解为木糖的过程中,随时间增加,终产物木糖的产量也增加,当积累到 一定量时,会使酶促反应速率降低并抑制反应的继续进行。一般不同来源的β-木糖巧酶的 木糖耐受性都是极低的,尤其是真菌仅能耐受2~lOmM的木糖(Zanoelo et al.J Ind Microbiol Biotechnol ,2004,31:170-176),因此,高木糖耐受性的β-木糖巧酶在半纤维素 降解过程中有巨大潜在应用价值。 k阿拉伯糖是一种没有热量的甜料,能抑制水解双糖的酶,抑制因摄入薦糖而导 致的血糖升高,因此可W抑制肥胖、预防并治疗与高血糖相关的疾病;此外,1^-阿拉伯糖可 用于合成核巧类似物等抗病毒药物,治疗白血病、癌症的化疗药物等。心阿拉伯糖的工业提 取方法一般是采用碱提取植物中的半纤维素,然后酸水解,但该方法工艺成本高,环境污染 严重。因此,高效、节能、环保的生物转化方法生产心阿拉伯糖,对我国的生物能源产业和功 能糖产业都有非常重大的意义。 中国专利公开号102051350A,公开了一种适冷木糖巧酶/阿拉伯糖巧酶和编码该 酶的基因。该酶不仅有阿拉伯糖巧酶和木糖巧酶的功能,而且能够在低溫的环境下保持较 高的活性,但该酶的木糖耐受性较小,其环境适宜能力依旧难w满足现有工业需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶、其编码基因及 其制备方法,本专利技术提供的双功能半纤维素降解酶同时具有β-D-木糖巧酶和〇寸-阿拉伯糖 巧酶活性,能将木二糖、木Ξ糖、木四糖彻底水解成木糖,而且具有较高的木糖耐受性。 本专利技术的目的之一在于提供一种高木糖耐受性的双功能半纤维素降解酶,其氨基 酸序列如SEQ ID NO.2所示,共542个氨基酸,其理论分子量为61.85kDa。 本专利技术的高木糖耐受性的双功能半纤维素降解酶XylRBM26最适pH为6.5 ;在 抑5.0-10.0的缓冲液处理化,酶活力剩余80 % W上;最适反应溫度为50°C,在45°C和50°C下 处理比,活性分别能保持95%、83% W上;该酶具有较高的木糖耐受性,木糖浓度高达500mM 时仍有50%的相对剩余酶活。在pH6.5及50°C下该酶能有效地水解4-Nitrophenyl-f3-D- 巧lopyranoside、4-化tro地enyl-a-karabino化ranoside,而不能水解燕麦木聚糖、山毛 样木聚糖、簇甲基纤维素钢、昆布多糖、β-葡聚糖、微晶纤维素、4-化*'〇9}161171-〇-0- glucopyranoside、4-Ni1:;ropheny;L-a-D-galactopyranoside,说明该酶同时具有 β-D-木糖 巧酶和αΑ-阿拉伯糖巧酶活性,将该酶与木二糖、木Ξ糖、木四糖反应2地,发现水解产物均 为木糖。 本专利技术的目的之二在于提供一种编码上述技术方案所述的双功能半纤维素降解 酶的基因,其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。[00川本专利技术通过Miseq基因组测序仪测序Massilia SP.RBM26的基因组DNA,经序列分 析、功能注释发现双功能酶的编码基因 XylRBM26。通过PCR的方法分离克隆基因 XylRBM26, 其全长为1629bp,起始密码为ATG,终止密码为TAG,GC含量为67.8 %。经NCBI网站的BLASTP 比对,该酶XylRBM26与GenBank中Massilia timonae来源的假想蛋白(WP005666758)具有最 高的一致性,为92%,该假想蛋白归类于糖巧水解酶第43家族,但其蛋白活性并未研究;与 确定活性的Bifidobacterium animalis subsp.lactis 68-12来源的6則3661日- xylosidase(ADC85541)一致性为42.37 %。而与确定活性的堆肥宏基因组uncultured bacterium来源細43be1:a-巧losidase(LC025936)-致性仅为12.73%。W上比对结果说明 该酶Xy 1RBM26是一种新的糖巧水解酶。 本专利技术的目的之Ξ在于提供一种包含上述技术方案所述的基因的重组表达载体, 将上述基因插入到表达载体中,使其核巧酸序列与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一 个最优选的实施方案,将本专利技术的编码基因和表达载体祀asy-E2通过T-A方式相连接,得到 重组大肠杆菌表达质粒祀asy-E2-XylRBM26。 本专利技术的目的之四在于提供一种利用上述技术方案所述的重组表达载体转化宿 主细胞所得的重组菌株,所述宿主细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽抱杆菌、乳 酸菌或丝状真菌。获得的重组菌株优选为大肠杆菌、酵母菌、芽抱杆菌或乳酸杆菌,优选为 重组菌株化21(DE3)/XylRBM26。 本专利技术的目的之五在于提供一种上述技术方案所述的双功能半纤维素降解酶的 制备方法,包括W下步骤: 将双功能半纤维素降解酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株,培养 重组菌株,诱导重组双功能半纤维素降解酶的表达; 回收并纯化所表达的双功能半纤维素降解酶,得到高木糖耐受性本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种高木糖耐受性的双功能半纤维素降解酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:许波戴利铭黄遵锡李俊俊唐湘华杨云娟
申请(专利权)人:云南师范大学
类型:发明
国别省市:云南;53

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