本发明专利技术涉及一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法。所述方法包括：菌种活化、种子液制备、发酵产丁二酸过程、以及回收菌体细胞，以丁二酸二钠为底物，转化合成苹果酸。所述应用目前尚无报道，与其他生物发酵生产苹果酸工艺相比，本发明专利技术的技术方案以回收的低活性的产丁二酸重组大肠杆菌为催化剂，丁二酸钠为底物，有氧转化合成苹果酸，其转化率达到90%以上，提高了细胞的利用效率，有效节约了成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体设及一种利用低活性下二酸生产菌株转化合 成苹果酸的方法，通过对微生物进行特定的菌种活化、种子液制备后，进行厌氧发酵生产下 二酸发酵结束后收集菌体细胞，在W下二酸钢为底物的特定培养基和培养环境下，有氧转 化合成苹果酸。
技术介绍
苹果酸是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为优异的食品添 加剂和功能性食品广泛应用于食品、医疗和保健等领域。目前苹果酸生产W富马酸或马来 酸为原料，加压与水蒸汽共热形成化-苹果酸，也可W慷醒为原料，经双氧水处理，在超声波 作用下转变而成。化学法由于生产工艺比较复杂，工艺条件要求高，分离精制技术难度大， 加之原料为化工产品，成本高和环境污染等原因使得苹果酸的应用受到限制。苹果酸的生 物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法 一般都是W富马酸为底物，利用具有高活性富马酸酶的微生物细胞或富马酸酶，采用细胞 反应器或固定化酶，将富马酸转化成k苹果酸。随着石油危机的出现，使得人们加大了对微 生物发酵法制备苹果酸的研究力度，运一时期人们用来发酵制备苹果酸的微生物主要是霉 菌，其中黄曲霉Asp. flavu为重点研究的对象，具体包括黄曲霉Asp. flavu，末曲霉 Asp.oryzae，寄生曲霉 Asp.parasiticus eTakao 等报道先用少根根霉（Rhizopus ahirrizus)或华根霉(化izopu chinensis)把糖质原料转化成富马酸，然后利用膜釀毕赤 酵母（Picha membrane aefaciens faciens)、普通变形杆菌（proteus vulgaris)及宛氏拟 青霉(paeciomyces varioti)之一，把富马酸转化成レ苹果酸的研究，但转化率不高（J. 化rment. Techno, 1983,61:643-645)。山东食品发酵工程实验室等人多年来致力于直接发 酵法生产レ苹果酸的研究，并且从±壤中分离筛选、诱变获得一株直接利用淀粉质原料生 产心苹果酸的高产菌株Aspergillus flavus HA5800,经过发酵条件的优化，7000升发酵罐 产酸达8.68%，糖酸转化率达83.5%，发酵周期112小时，为k苹果酸产业化奠定了基础。（中 国食品添加剂，2003，3:52-56)。但霉菌生长速度慢，产品生产强度偏低，开发对营养条件需 求简单、生长迅速、收率高的苹果酸酸生产菌株是加速生物法替代石化法生产的关键。 利用大肠杆菌来发酵生产苹果酸，是利用了大肠杆菌生长快速、培养条件简单、安 全性好、易操作易改造等诸多优点。目前，Soo化η Moon等人报道了一株生产苹果酸的重组 大肠杆菌，其原理是敲除野生大肠杆菌中的憐酸转乙酷酶基因（PTA)并过量表达 Mannheimia succiniciproducens中憐酸締醇式丙酬酸簇化激酶(PCK)，结果在有氧条件下 1 化生产苹果酸9.25 g L-i(Biochemical Engineering Journal ,2008，40: 312-320)。但 其收率仅61%，且产物浓度较低。本专利技术利用回收的产下二酸重组大肠杆菌，W下二酸钢为 原料有氧发酵制备苹果酸的方法未见公开，而运种应用将有效提高产下二酸重组大肠杆菌 的利用效率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是在产下二酸重组大肠杆菌发酵结束时，通过一种溫 和、高效的方法回收菌体细胞，并最终能够转入新鲜培养基中W下二酸钢为原料转化合成 苹果酸。 为实现本专利技术的技术目的，本专利技术采用W下技术方案： 一种利用低活性下二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法，包括W下步骤： (1) 菌种活化:从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37°C下培养12 h; (2) 种子液制备:从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37°C，200 r/min条件 下摇瓶培养6~8 h，至菌体密度(0D600)值在0.6~0.8之间； (3) 发酵产下二酸过程:按3~10%的接种量接种发酵培养基，先通空气有氧培养至菌体 密度(0D600)值在30~40之间，再W0.1~0.2 vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵 罐中厌氧环境，并W碳酸钢作为酸中和剂控审虹Η值在6.4-7.0之间，控制溫度在35~40°C; (4) 在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，溫度及发酵液 pH值，W下二酸二钢为底物，转化合成苹果酸。 进一步地，所述的菌种为产下二酸重组大肠杆菌。 进一步地，所述的菌种为Escherichia coli AFP111。 进一步地，所述步骤(4)中厌氧发酵结束时，回收的菌体细胞转化采用的转化培养 基为JSM-CN培养基。 进一步地，所述的JSM-CN培养基含有：葡萄糖40 g · L-1;巧樣酸3 g · L-1; Na2HP〇4 · 7此0 3 邑· L-i;K此P〇4 8 邑· L-1;(畑4)2册〇4 8 邑· L-i;NH4C1 0.2 邑· L-i;MgS〇4 · 7出0 1.00 邑· L-i;CaCl2 · 2出0 10.0 m邑· L-i;ZnS〇4 · 7出0 0.5 m邑· L-i;CuCl2 · 2此0 0.25 m邑· L-i;MnS〇4 ·此0 2.5 m邑· L-i;CoCl2 · 6出0 1.75 m邑· L-1;曲B03 0.12 m邑；A!2 (S〇4)3.xH2〇 1.77 mg.L-i;Na2Mo〇4.2H2〇 0.5 mg.L-i;巧樣酸铁 16.1 mg.L-i;VBi 20 .mg L-i;生物素 2 mg · [1。 进一步地，步骤(4)中所述的溶氧>20%，所述溫度为33~36°C，所述pH在6.8~7.5之 间。 本专利技术的有益效果在于： 本专利技术的技术方案W回收的低活性的产下二酸重组大肠杆菌为催化剂，下二酸钢为底 物，有氧转化合成苹果酸，其转化率达到90%w上，提高了细胞的利用效率，有效节约了成 本。【附图说明】 图1苹果酸生产过程曲线图。【具体实施方式】 本专利技术中所述的菌株及培养基： 菌株：Escherichia coli AFPl 11，菌株来源为：Appl ied and environmental microbiology ,2001,67(1): 148-154。申请人首先通过查阅到该生物材当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12 h；（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200 r/min条件下摇瓶培养6~8 h，至菌体密度OD600值在0.6~0.8之间；（3）发酵产丁二酸过程：按3~10%的接种量接种发酵培养基，先通空气有氧培养至菌体密度OD600值在30~40之间，再以0.1~0.2 vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4‑7.0之间，控制温度在35~40℃；（4）在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成苹果酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马江锋，钱秀娟，董维亮，章文明，吴昊，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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