本发明专利技术提供一种基质金属蛋白酶酶切序列肽、表达载体、多核苷酸序列及应用，所述酶切序列肽是酶切序列的串联多肽，该串联多肽是由2-15个基质金属蛋白酶酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列，所述单体肽为Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，单体肽之间由甲酸的切割位点(Glu-Pro)连接起来。本发明专利技术的多核苷酸序列为编码本发明专利技术的串联多肽的核苷酸序列。本发明专利技术成功实现了小分子基质金属蛋白酶酶切序列肽在微生物工程菌中的高效表达，制得的基质金属蛋白酶酶切序列肽为其在科学研究相关产品及药物等产品的市场化提供了技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种基质金属蛋白酶酶切序列肽的串联多肽、编码该串联多肽的核苷酸序列、表达载体及所述多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产基质金属蛋白酶酶切序列中的应用。
技术介绍
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一组含Zn2+的、参与降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的最重要的蛋白酶。目前研究已经证实MMPs参与人体众多的生理和病理过程，因其能对基底膜和细胞外基质进行分解从而造成肿瘤的侵袭和转移成为肿瘤学研究的一个热点。MMP2是MMPs超家族中的能降解明胶的胶原酶。在很多肿瘤细胞中，MMP2都出现过表达的现象，如在乳腺癌细胞中，MMP2就出现过量表达的情况。MMP2降解明胶是通过切割明胶中的特异性的氨基酸序列，即MMP2酶切序列肽，故我们可以把MMP2蛋白作为治疗肿瘤的靶蛋白，通过把抗肿瘤的化学小分子连接到MMP酶切序列肽上，可以定向的把抗肿瘤的小分子带到肿瘤细胞周围，MMP2蛋白切割MMP2酶切序列肽后，释放抗肿瘤小分子药物;一方面达到了抗肿瘤药物在肿瘤细胞上面的富集，另一方面可以把小分子释放出来更特异的作用于肿瘤细胞。但是现有技术中把MMP2酶切序列肽的基因克隆到工程载体上并把载体导入工程菌种，小分子肽在微生物工程菌中表达率低及易降解，原料生产复杂而且成本高。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术中小分子肽在微生物工程菌中表达率低及易降解的问题，本专利技术提供一种MMP2酶切序列的串联多肽，通过生物学的方法，把MMP2酶切序列肽的基因克隆到工程载体上并把载体导入工程菌种，最后生产MMP2蛋白酶切割序列肽单体，小分子肽表达率提高，且不易降解，为以后的药物设计提供原料支持，也降低了成本。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现:—种基质金属蛋白酶-MMP2酶切序列的串联多肽，该串联多肽是由2-15个MMP2酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列；所述单体肽序列为:Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，单体肽之间由甲酸的酶切割位点连接，所述切割位点为Glu-Pro。优选的，所述串联多肽是由8个MMP2酶切序列单体肽通过甲酸的酶切位点首尾串联而成的串联多肽。优选的，所述单体肽的氨基酸序列为序列表中SEQID NO:1所述的氨基酸序列。—种编码上述串联多肽的多核苷酸序列。优选的，所述多核苷酸序列为SEQID NO: 2。—种所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽中的应用。优选的，所述表达生产MMP2酶切序列肽的微生物为原核微生物。—种重组载体，所述重组载体含有多核苷酸序列所述的任一种多核苷酸序列。(三)有益效果本专利技术提供了，本专利技术相对于现有技术，其有益效果如下:本专利技术构建了串联多肽及编码它的多核苷酸序列及重组载体，采用基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽，而且成功实现了小分子MMP2酶切序列肽在微生物工程菌中的高效表达，表达的融合蛋白经过特异性的甲酸酶切和近一步的分离纯化，制得了高产量的MMP2酶切序列肽单体。本专利技术采用基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽，采用化学方法切割，SP甲酸切割，简化了分离纯化工艺复杂，解决了产量低的问题，而且生产不受原料限制，能进行工厂化自动化大规模生产，降低了生产成本，为MMP2酶切序列在科学研究相关产品及药物等产品的市场化提供了技术支持。【附图说明】为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例中重组表达载体的构建过程图。【具体实施方式】为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。将本专利技术的串联多肽的氨基酸序列按照偏爱密码子翻译成的多核苷酸序列定义为ACS-N，两个丽P2酶切序列肽单体串联的N为2，三个MMP2酶切序列单体串联的N为3，其余的依次类推。将本专利技术的多核苷酸序列通过本领域熟知的基因工程技术，来表达生产MMP2酶切序列肽。将本专利技术的串联多肽的氨基酸序列，按照偏爱密码子如大肠杆菌偏爱密码子、酵母菌偏爱密码子等翻译成多核苷酸序列。化学合成该多核苷酸序列后，通过本领域熟知的基因工程技术，可构建各种原核表达载体、真核表达载体和穿梭质粒载体，并转化原核、真核生物以得到表达。具体过程可如下所述:化学合成双链目的基因ACS-N片段，根据选定的表达载体的多克隆位点，合成时在ACS-N序列的5 ’端和3 ’端加上可连接到载体上的限制性酶切位点和终止密码子，例如，在5 ’端加上BamHl位点，在3’端加上Hind III位点，并克隆至高拷贝质粒例如pMD19_T质粒中。转入宿主菌例如大肠杆菌DH5a中保存。扩增培养并提取含目的基因的高拷贝质粒，同时扩增培养并提取表达载体;克隆质粒和表达载体分别经过双酶切，割胶分别回收目的基因片段和表达载体片段，将目的基因片段和表达载体片段用Solut1n I快速连接酶连接，即构建了含有DNA序列ACS-N的重组载体，例如图1所示的重组质粒pET28a-his-sum0::ACS-N。把获得的重组载体转化宿主菌，例如大肠杆菌BL21，获得用来表达ACS-N多肽的转化子。将扩繁后的工程菌诱导，诱导产物用甲酸酸切割后，用反向高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，纯化得到的MMP2酶切序列肽单体经过氨基酸序列分析，其序列为Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，表明利用基因工程方法成功制备MMP2酶切序列肽。甲酸切割的最佳条件是50 %甲酸终浓度70摄氏度切割30小时。RP-HPLC纯化MMP2酶切序列肽的最佳条件为:乙腈浓度15%，三氟乙酸浓度I %，洗脱速度1.5mL/min，专利技术人分别将2?11个MMP2酶切序列肽单体用甲酸的酶切位点Glu-Pro串联起来构成系列氨基酸序列，并全部化学合成了对应于这些串联多肽的系列多核苷酸序列，并依次构建了含有不同MMP2酶切序列肽串联数的系列工程菌BL21/pET-28a::ACS-N，分别扩增这些工程菌后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导产物用甲酸酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体肽ACS-1含量，结果表明8个MMP2酶切序列肽单体串联起来表达，表达量最大，达到500mg/L。实施例1:2个MMP2酶切序列肽单体串联的ACS-2多肽大肠杆菌表达系统的构建及表达。将两个MMP2单体Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu用甲酸切割位点Glu-Pro连接构成2拷贝的串联多肽(14肽)，该串联多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所述，具体如下: Pro-Leu-Gly-Met-Th本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基质金属蛋白酶‑MMP2酶切序列的串联多肽，其特征在于，该串联多肽是由2‑15个MMP2酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列；所述单体肽序列为：Pro‑Leu‑Gly‑Met‑Thr‑Ser‑Glu，单体肽之间由甲酸的酶切割位点连接，所述切割位点为Glu‑Pro。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余继刚，宋瑞，李珂，汤伟强，李坤，陈雷，
申请(专利权)人：合肥安德生制药有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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