一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状分子标记gga-miR-1662及其检测方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-1662，发明专利技术人经过研究发现，gga-miR-1662可以通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明专利技术人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及基因工程
，提供了一种鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记 gga-miR-1662及其检测方法。
技术介绍
肠炎沙口氏菌（Salmonella enteritidis)为革兰氏阴性菌，是世界公认的食源性 致病菌之一，不仅对蛋鸡生产造成重大影响，而且它能通过家禽副产品给人类的健康带来 很大的威胁。运种病菌主要是通过动物性产品包括禽肉，鸡蛋和奶类及奶制品等导致人中 毒甚至死亡。因此如何获得抗性高的遗传个体成为亟待解决的问题之一。 小RNA(miRNA)是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA，与祀基因3'UTR(非翻译 区）结合在转录后水平调控祀基因的表达，在细胞增殖、分化、调亡、神经发育、脂肪代谢等 多个生物学过程中发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种鸡 肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记gga-miR-1662及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-1662，专利技术人经过研究发现，gga-miR-1662可W通过调控TLR1LA基因的表达调控 肠炎沙口氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可W作为肠炎沙口氏菌感染抗性检测的分子 标记，专利技术人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。 专利技术人提供的具体技术方案如下： 专利技术人首先提供了一种鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记，该抗性分子标记为鸡 miRNA gga-miR-1662,其核巧酸序列如沈Q ID NO: 1所示； 专利技术人进一步给出了该分子标记的检测方法如下：[000引 gga-miR-1662的表达量检测 miRNA反转录 用One St邱PivimeS.cript麽miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)试 剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20化(具体见表1)。反应程序为:37°C，60min;85°C， 5s;反应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用； 表1 miRNA反转录体系（20yL)其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得， gga-miR-1662 巧光定量 PCR 根据gga-miR-1662成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。 利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stratagene MX3000P巧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所 /J、- 〇 表2 miRNA定量检测引物 其中〉gga-miR-1662和U6分别作为Forward qPCR Primer,而Uni-miR qPCR Primer选用试剂盒中自带引物； 巧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环；最后添加溶解曲线(95°CImin，62°C30s，95°C30s)，1个循环，每个cDNA样品重复Ξ 次。WU6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。 表3巧光定量PCR体系（2化L) 专利技术人为了验证上述gga-miR-1662的功能采用了祀基因检测的方式，利用 TargetScan及miRanda等软件预测到TLR1LA是gga-miR-1662的祀基因。结果发现通过分别 比较肠炎沙口氏菌感染组与未感染组中miRNA与祀基因的调控方向，可知gga-miR-1662在 感染组中显著下调，祀基因化R1LA在感染组中的表达量显著高于未感染组(如图1所示），即 gga-miR-1662与化R1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-1662可W通过 调控化R1LA基因的表达调控肠炎沙口氏菌对鸡的感染。因此gga-miR-1662可W作为肠炎沙 口氏菌感染抗性检测的分子标记。 综上所述，本专利技术提供了一种鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记及其检测方法， 该抗性分子标记为鸡gga-miR-1662，专利技术人经过研究发现，gga-miR-1662可W通过调控 化R1LA基因的表达调控肠炎沙口氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可W作为肠炎沙口氏 菌感染抗性检测的分子标记，专利技术人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种 奠定基础。【附图说明】图1为gga-miR-1662与祀基因化RILA在感染组相对未感染组中的表达差异倍数柱 状图，由图可知，gga-miR-1662在感染组中显著下调，TLR1LA在感染组中的表达量显著 高于未感染组，即gga-miR-1662与TLR1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga- miR-1662可W通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙口氏菌对鸡的感染。【具体实施方式】 下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术； 实施例1 gga-miR-1662的表达量检测 miRNA 反转录用One St邱'PrlmeSc.ri:pt'?miRNA cDNA Synthesis Kit(F*e;rfect Real Time)试 剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20化(表1)。反应程序为:37°C，60min; 85°C，5s;反 应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用； 表1 miRNA反转录体系（20yL) Γ00331 其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得， gga-miR-1662 巧光定量 PCR 根据gga-miR-1662成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。 利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stratagene MX3000P巧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所 /J、- 〇 表2 miRNA定量检测引物 [00；3 引 其中〉gga-miR-1662和U6分别作为Forward qPCR Primer,而Uni-miR qPCR Primer选用试剂盒中自带引物； 巧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环；最后添加溶解曲线(95°CImin，62°C30s，95°C30s)，1个循环，每个cDNA样品重复Ξ 次。WU6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。 表3巧光定量PCR体系（20μυ 实施例2 祀基因 TLRILA的表达量检测 mRNA反转录 根据试剂盒说明书要求，利用TaKaRa Primer ScriptTM RT reagent kit (Perfect Real Time)试剂盒将mRNA反转录为cDNA，放在-20°C保存备用。反转录体系如表4 所示。反转录步骤:37°C，15min;85°C，5s。 表4反转录体系 [004引 TLR1LA 巧光定量 PCR根据N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记，该抗性分子标记为鸡miRNA gga‑miR‑1662，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李显耀，吴桂贤，刘丽英，刘肖意，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37