一种蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交的方法技术

技术编号:13210073 阅读:154 留言:0更新日期:2016-05-12 15:33
本发明专利技术涉及细胞遗传学与分子生物学技术领域,具体涉及一种蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交的方法。通过制备染色体玻片标本、18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性、探针与染色体共变性、杂交与杂交后洗脱、制片与信号检测步骤,建立蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交技术,本发明专利技术是一种快速、精确的染色体荧光原位杂交技术,观察到分散好、荧光信号强的染色体分裂相,能更好地辨析蒙古沙冬青染色体,以应用于蒙古沙冬青的核型分析与进化研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞遗传学与分子生物学
,更具体地说,涉及。
技术介绍
焚光原位杂交(fluorescencein situ hybridizat1n, FISH)是20世纪80年代末开始发展起来的一种重要的非放射性标记原位杂交技术,在研究植物分子细胞遗传学、基因扩增、基因作图及植物进化和亲缘关系的鉴定上已广泛应用,重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原位杂交,容易产生较高的分辨率,因为这些DNA多拷贝序列在染色体上可达几十个kb或几个Mb。核糖体rRNA基因是生物最重要的管家基因之一,其转录产物与核糖体蛋白质一起组装成核糖体。高等植物核主体抑嫩(185、5.85、285)和55 rDNA是由高度重复的序列组成,它们是基因编码区,选择压力大,属高度保守区,在植物基因组中有几百乃至上千拷贝,它们以串联重复排列的方式成簇分布在染色体的一个或数个部位,采用18S rDNA和5SrDNA探针对植物染色体进行荧光原位杂交(FISH)可以定位18SrDNA和5S rDNA在染色体上的位置,为植物基因组的进化和核型分析提供重要信息。蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongo I i cus )是豆科蝶形花亚科沙冬青属(Ammopiptanthus)旱生植物,为古老的残遗、濒?危物种,主要分布在我国西北地区的沙漠、荒漠区,是该区唯一的常绿阔叶灌木。由于蒙古沙冬青染色体较小及制片方法问题,染色体核型分析结果不一致,先后有两个研究组报道,蒙古沙冬青核型公式为2n=2x=18=6m(2SAT)+ 10sm(2SAT)+2st,属于3A型,即由3对中部、5对近中部和I对近端部着丝点染色体组成,对于蒙古沙冬青染色体形态小,相似程度高,需要用荧光原位杂交技术,以更精密的辨析蒙古沙冬青的染色体,通过改造染色体制片技术和优化传统染色体原位杂交方法,获得分散开,形态好,荧光信号强的中期染色体玻片,更好地辨析蒙古沙冬青染色体,以应用于蒙古沙冬青的核型分析与进化研究.因此,当前技术一种快速、精确的染色体荧光原位杂交技术,观察到分散好、荧光信号强的染色体分裂相。
技术实现思路
本专利技术提供。为了解决上述问题,本专利技术所采用的技术方案如下:,包括以下步骤: SI:染色体玻片标本的制备,蒙古沙冬青种子在28°C温箱中常规培养,待根尖生长至2-3厘米时,切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润,置密闭容器中用N2O处理2.5小时,取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟,即转入70%乙醇中固定,置_20°C长期备用,取固定后的2-3个根尖,用蒸馏水洗净,切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中,37°C解离45分钟,离心先后用冷蒸馏水,无水乙醇洗涤两遍,最后放入30微升冰醋酸中,每张玻片滴5微升左右悬液展片,空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体,镜检分散良好的染色体玻片,置_20°C长期备用; S2:18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性,选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物,以蒙古沙冬青为模板扩增重复序列,采用Nick translat1n法制备探针,端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针,Aml3引物为fwd和Aml3以蒙古沙冬青为模板扩增重复序列;分别标记FITC绿色和Texas Red红色荧光; S3:探针与染色体共变性,制备好的染色体玻片,经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理I分钟固定染色体,在染色体位置加5微升的探针,其质量不超过100纳克,盖上盖玻片,放入密闭保湿的饭盒中,在沸水中煮沸15分钟,迅速冷却变性的染色体和探针; S4:杂交与杂交后洗脱,遮光变性的玻片和探针,取出玻片放入55°C烘箱中,经过大于4小时的保温复性杂交,取出玻片置于含2 X SSC溶液的玻片染色缸中,室温漂洗5分钟,去除玻片,接着转至另一含2 X SSC溶液的玻片染色缸,55°C漂洗25分钟,取出玻片,空气晾干后保湿; S5:制片与信号检测,在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI和5微升2 X SSC溶液,盖上盖玻片,在盖玻片上覆上吸水纸,用橡皮敲打1-2分钟,使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察,找到良好的染色体分裂相,用不同的激发光获得,蓝色,红色和绿色的杂交信号;用Lecia CW4000 FISH software进行图像米集与合成。进一步地,所述步骤S2中的Nick translat1n法制备探针,成分为:DNA (200纳克/毫升),10.0微升;10X Nick translat1n缓冲液,2.0微升;荧光标记的dNTP(ImM) ,0.5微升;无荧光标记的dNTPs(2 mM),2.0微升;DNA聚合酶I(10U/微升),8.0微升;DNase (100mU/微升),0.4微升;总体积22.9微升;制备方法为:混合物混匀后放入PCR仪15° C保温2小时;加入175微升的含140纳克/微升鲑鱼精DNA的5 X TAE pH 5.2终止反应,并混匀,加入500微升大于2小时沉淀探针后16000rpm;离心30分钟,70%乙醇洗涤2遍,加入100微升的2 XSSC溶解探针,使探针终浓度为20纳克/微升,_20°C避光储存备用。更进一步地,所述蒙古沙冬青的核型模式为2n = 2x =18= 2sm(SAT)+ 6 m + 8sm + 2st0相比于现有技术,本专利技术的有益效果为: (I)本专利技术在现有技术基础上,用N2O处理根尖,采用90%冰醋酸固定1min后转入70%乙醇保存,酶解后,用冰浴蒸馏水与无水乙醇两次洗涤后,加冰醋酸展片,使蒙古沙冬青中期染色体凝聚较好,根尖细胞解离充分,染色体分散均匀、容易计数。(2)本专利技术的探针制备放在15°CPCR仪保温2 h,时间温度精确控制,然后沉淀纯化探针。(3)采用紫外交联仪固定玻片染色体,减少染色体被洗脱风险。(4)用沸水浴煮沸探针与染色体一起变性,方法简单,无污染。(5)采用2XSSC室温洗脱和2XSSC 55°C洗脱相结合的方法,步骤简便,无污染。(6)本专利技术清楚地显示了蒙古沙冬青的染色体,荧光信号强,杂交特异性高,确定了适合蒙古沙冬青的FISH方法。(7)本专利技术通过观察18SrDNA、5SrDNA、Aml3和端粒(Telomere)的探针在蒙古沙冬青染色体上的分布,辨析同源染色体与非同源染色体,有助于核型分析,对于蒙古沙冬青染色体物理图谱构建,引种栽培和资源的保护利用具有重要的理论和实践意义。【附图说明】图1为蒙古沙冬青中期分裂相图像; 图2为蒙古沙冬青18S rDNA(绿色,白色箭头)和端粒(红色)信号点分布图像; 图3为蒙古沙冬青18S rDNA(绿色)和端粒(红色)核型分析图; 图4为蒙古沙冬青5S rDNA(绿色,白色箭头)和Aml3(红色)信号点分布图像; 图5为蒙古沙冬青5S rDNA(绿色)和Aml3(红色)核型分析图; 图6为蒙古沙冬青18SrDNA、5SrDNA、Aml3和端粒(Telomere)核型分析模式图;图7为蒙古沙冬青的5S rDNA (a_d)红色和18S rDNA (e_h)绿色荧光原位杂交结果图。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行本文档来自技高网
...

【技术保护点】
一种蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:染色体玻片标本的制备,蒙古沙冬青种子在28℃温箱中常规培养,待根尖生长至2‑3厘米时,切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润,置密闭容器中用N2O处理2.5小时,取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟,即转入70%乙醇中固定,置‑20℃长期备用,取固定后的2‑3个根尖,用蒸馏水洗净,切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中,37℃解离45分钟,离心先后用冷蒸馏水,无水乙醇洗涤两遍,最后放入30微升冰醋酸中,每张玻片滴5微升左右悬液展片,空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体,镜检分散良好的染色体玻片,置‑20℃长期备用;S2:18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性,选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物,以蒙古沙冬青为模板扩增重复序列,采用Nick translation法制备探针,端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针,Am13引物为fwd和Am13以蒙古沙冬青为模板扩增重复序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:唐宁张边江陈全战
申请(专利权)人:南京晓庄学院
类型:发明
国别省市:江苏;32

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1