本发明专利技术涉及一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法，包括配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液、菌丝液体培养、钙离子和水杨酸诱导、菌丝收集、菌丝三萜提取与检测。在灵芝液体发酵过程中加入钙离子和水杨酸进行诱导，能够显著提高灵芝菌丝中三萜的含量，菌丝的三萜含量达48.97 mg/g，比对照组高48.26%，有效提高灵芝的质量，而且操作方法简单、成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高食用菌液体发酵中三萜含量的方法，具体涉及。技术背景灵芝古称为瑞草，又名为赤芝、万年蕈、红芝、灵芝草等，在真菌的分类地位上属于真菌界(Mycota)，担子菌亚门(Basid1mycotina),层菌亚纲(取!1161101115^6丨68)，非裙菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyproraceae)，灵芝属(Ganoderma)。灵芝三蔽具有良好的药理作用，主要表现在抑制癌细胞的生长、保肝护肝、降血压、抗HIV等。灵芝品质的好坏与灵芝三萜的含量着密切相关。目前生产上获得灵芝三萜类化合物的来源主要是成熟子实体和液体发酵的菌丝。通过液体发酵技术来提取灵芝的三萜的周期较短，且操作简单。随着市场上灵芝产品的不断推出，就要求更加高效地生产灵芝三萜。因此，探索如何有效提高灵芝液体发酵中三萜的含量，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，适应市场需求，也为灵芝有效成分分析提供依据。本专利技术的，操作步骤如下: (1)配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液:用CaCl2和无菌水配制1OmMl?离子水溶液；用水杨酸和乙醇，配制150μΜ水杨酸乙醇溶液； (2)菌丝液体培养:用9mm打孔器从长满灵芝菌丝的平板上打出8块菌丝接入100mL液体TOA中，28°C，150rpm摇床培养6-7天，然后再静置培养5_6天;所述液体PDA配方为:200 g马铃薯煮沸浸出液，20 g葡萄糖，加水定容到1000mL，121°C灭菌30min; (3)钙离子和水杨酸诱导:取步骤(1)的钙离子水溶液l_5mL和水杨酸乙醇溶液0.5-1.5mL，混勾，采用滤膜除菌法加入到步骤(2)已接种培养的PDA培养液中，28°C生化培养箱中诱导处理1-2天； (4)菌丝收集:收集步骤(3)诱导处理后的菌丝，并除去接种块，用蒸馏水洗涤3-5次，置于60°C烘箱中烘干至恒重； (5)菌丝三萜提取与检测:取步骤(4)烘干的菌丝用乙醇常温浸提2h后，150W超声0.5h，60°C旋转蒸干，用甲醇溶解定容，并采用香草醛-冰醋酸法检测三萜含量。本专利技术的优点及有益之处:在灵芝液体发酵过程中加入钙离子和水杨酸进行诱导，能够显著提高灵芝菌丝中三萜的含量，提高灵芝的质量，而且操作简单成本低。灵芝三萜是灵芝中主要的药理活性成分，通过添加钙离子和水杨酸的诱导，能够有效的提高灵芝液体发酵中三萜的含量，菌丝的三萜含量达48.97 mg/g，比对照组高48.26%。【附图说明】图1为不同培养时间菌丝的三蔽含量不意图。图中，横坐标表不培养的天数，纵坐标表不三蔽含量mg/g。图2为添加钙离子和水杨酸对灵芝三萜含量的影响示意图。图中，CK为对照，Ca+SA表示用本专利技术的方法添加钙离子和水杨酸进行诱导处理；*表示与对照有显著差异，P<0.05；纵坐标表不三蔽含量mg/g。未添加妈离子和水杨酸的菌丝，三蔽含量为33.03 mg/g；添加钙离子和水杨酸的菌丝三萜含量为48.97 mg/g，比对照组高48.26%。【具体实施方式】为了充分公开本专利技术的提高灵芝液体发酵中三萜的含量的方法，以下结合实例加以说明。实施例1:。包括以下步骤: (1)配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液:用CaCl2和无菌水配制10mMl?离子水溶液；用水杨酸和乙醇，配制150μΜ水杨酸乙醇溶液； (2)菌丝液体培养:采用市场购买的灵芝菌株，在PDA斜面进行活化后接入90mm的平板，待平板上长满菌丝后，用9mm打孔器打出8块菌丝接入100 mL液体PDA中，28°C，150rpm摇床培养7天，然后再静置培养5天;所述液体PDA配方为:200 g马铃薯煮沸浸出液，20 g葡萄糖，加水定容到1000mL，121°C灭菌30min;不同培养时间菌丝的三萜含量如图1所示；当培养到第13天，菌丝中三萜含量达到最大值33.03mg/go (3)钙离子和水杨酸诱导:取步骤(1)的钙离子水溶液lmL和水杨酸乙醇溶液lmL，混匀，采用滤膜除菌法，即采用lmL无菌注射器经孔径为0.22μπι已灭菌的有机滤头，加入到步骤(2)已接种培养的TOA培养液中，28°C生化培养箱中诱导处理1天。添加钙离子和水杨酸对灵芝三萜含量的影响如图2所示，添加钙离子和水杨酸的菌丝三萜含量为48.97 mg/g，比对照组高48.26%。(4)菌丝收集:收集步骤(3)诱导处理后的菌丝，并除去接种块，用蒸馏水洗涤5次，置于60°C烘箱中烘干至恒重； (5)菌丝三萜提取与检测:称取烘干的菌丝0.2g，用30mL85%(v/v)乙醇常温浸提2h后，150W超声0.5h，60°C旋转蒸干，最后用甲醇溶解定容至25 mL。采用香草醛-冰醋酸法检测三蔽含量。所述香草醛-冰醋酸法检测三萜含量:取0.2mL的样品溶液于具塞试管中，在60°C水浴锅中蒸干，加入0.4mL的5%香草醛-冰醋酸(现配现用)和lmL的高氯酸，摇匀后60°C水浴15min.冷却至室温后再加入5mL的冰醋酸，摇匀后室温静置0.5h，546nm进行0D值检测。实施例2:—种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法。包括以下步骤: (1)配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液:用CaCl2和无菌水配制10mMl?离子水溶液；用水杨酸和乙醇，配制150μΜ水杨酸乙醇溶液； (2)菌丝液体培养:采用市场购买的灵芝菌株，在PDA斜面进行活化后接入90mm的平板，待平板上长满菌丝后，用9mm打孔器打出8块菌丝接入100 mL液体PDA中，28°C，150rpm摇床培养6天，然后再静置培养6天； (3)钙离子和水杨酸诱导:取步骤(1)的钙离子水溶液5mL和水杨酸乙醇溶液1.5mL，混匀，采用滤膜除菌法加入到步骤(2)已接种培养的的PDA培养液中，28°C生化培养箱中诱导处理2天。(4)菌丝收集:用纱布收集步骤(3)诱导处理后的菌丝，并除去接种块，用蒸馏水洗涤3次，置于60°C烘箱中烘干至恒重。(5)菌丝三萜提取与检测:称取烘干的菌丝0.2g，用30mL85%(v/v)乙醇常温浸提2h后，150W超声0.5h，60°C旋转蒸干，最后用甲醇溶解定容25 mL，并采用香草醛-冰醋酸法检测三萜含量。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡依本专利技术申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本专利技术的涵盖范围。【主权项】1.，其特征在于操作步骤如下: (1)配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液:用CaCl2和无菌水配制lOmMli离子水溶液；用水杨酸和乙醇，配制150μΜ水杨酸乙醇溶液； (2)菌丝液体培养:用9mm打孔器从长满灵芝菌丝的平板上打出8块菌丝接入100mL液体TOA中，28°C，150rpm摇床培养6-7天，然后再静置培养5_6天;所述液体PDA配方为:200 g马铃薯煮沸浸出液、20 g葡萄糖、加水定容到1000mL，121°C灭菌30min; (3)钙离子和水杨酸诱导:取步骤(1)的钙离子水溶液1_5mL和水杨酸乙醇溶液0.5-1.5mL，混勾，采用滤膜除菌法加入到步骤(2)已接种培养的PDA培养液中，28°C生化培养箱中诱导处理1-2天； (4)菌丝收集:收集步骤(3)诱导处理后的菌丝，并除去接种块，用蒸馏水洗涤3-5次，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法，其特征在于操作步骤如下：（1）配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液：用CaCl2和无菌水配制10mM钙离子水溶液；用水杨酸和乙醇，配制150µM水杨酸乙醇溶液；（2）菌丝液体培养：用9mm打孔器从长满灵芝菌丝的平板上打出8块菌丝接入100 mL液体PDA中，28℃，150rpm摇床培养6‑7天，然后再静置培养5‑6天；所述液体PDA配方为：200 g马铃薯煮沸浸出液、20 g葡萄糖、加水定容到1000mL，121℃灭菌30min；（3）钙离子和水杨酸诱导：取步骤（1）的钙离子水溶液1‑5mL和水杨酸乙醇溶液0.5‑1.5mL，混匀，采用滤膜除菌法加入到步骤（2）已接种培养的PDA培养液中，28℃生化培养箱中诱导处理1‑2天；（4）菌丝收集：收集步骤（3）诱导处理后的菌丝，并除去接种块，用蒸馏水洗涤3‑5次，置于60℃烘箱中烘干至恒重；（5）菌丝三萜提取与检测：取步骤（4）烘干的菌丝用乙醇常温浸提2h后，150W超声0.5h，60℃旋转蒸干，用甲醇溶解定容，并采用香草醛‑冰醋酸法检测三萜含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴小平，叶丽云，林强，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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