本发明专利技术公开了一种耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶及其制备方法，所述β-N-乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述方法包括：首先用包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因hJ5nag的重组载体，重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；然后培养重组菌株，诱导重组β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag表达；最后回收所表达的β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag。本发明专利技术的β-N-乙酰葡糖胺酶，最适pH6；最适温度为45℃；可催化水解几丁寡糖；在反应体系加入终浓度20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约69.5％活性；可与内切几丁质酶协同降解几丁质，可应用于海产品加工、医学、功能性食品等行业。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及 其制备方法。
技术介绍
几丁质是由Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖单体通过β_1，4键组成的多糖，广泛存在于真 菌、昆虫细胞壁以及甲壳类动物外骨骼中，其含量仅次于纤维素，因此几丁质的水解具有重 要的意义。内切几丁质酶可以把几丁质降解为几丁寡糖，而β-N-乙酰葡糖胺酶可催化几丁 寡糖降解为Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖，因而β-Ν-乙酰葡糖胺酶对几丁质的完全水解起到关键 性的作用；同时，由于内切几丁质酶会被几丁寡糖抑制，所以β-Ν-乙酰葡糖胺酶可解除几丁 寡糖对内切几丁质酶的抑制作用，从而与内切几丁质酶产生协同作用（Yang et al.， Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181-5190)。但是，大多数β_Ν_ 乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制，需要耐产物抑制的β-Ν-乙 酰葡糖胺酶才能使几丁质更有效地彻底水解(Yang et al·，Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181-5190)。根据氨基酸序列同源性，β-Ν-乙酰葡糖胺酶主 要归类于糖苷水解酶第3、20、73和84家族（Cantarel et al.，Nucleic acids research, 2009，37 :D233-D238) J-N-乙酰葡糖胺酶被广泛应用于功能性食品、保健品、化妆品、制药、 饲料添加剂和生物杀虫剂等领域（Yang et al·，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014,62:5181-5190)。例如，β-Ν-乙酰葡糖胺酶水解几丁寡糖的产物N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体具有抗炎作用，对于溃疡结肠炎和其他的胃肠炎症的治疗有很好的效果 (Salvatore et al.,Alimentary pharmacology&therapeutics,2000,14:1567-1579)，N-乙酰-D-胺基葡萄糖也应用于治疗儿童慢性肠炎疾病以及骨关节炎（Shikhman et al.， Annals of the rheumatic diseases，2005,64:89-94)〇
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及其制备方法，旨在 解决现有的β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制从而导致几 丁质水解效率较低的问题。 本专利技术是这样实现的，一种耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，所述耐产物抑制的 β-Ν-乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.1所示。 进一步，所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶总共含535个氨基酸，理论分子量为 55.89kDa，其中Ν端有25个氨基酸为预测信号肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA，成熟的 34-乙酰葡糖胺酶耵5仙8含510个氨基酸。 本专利技术的另一目的在于提供一种所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制备方 法，所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制备方法包括以下步骤： 首先用包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 hJ5nag的重组载体，重组载体为pEasy-E2- hJ5nag，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接，重 组载体转化宿主细胞，得重组菌株；然后培养重组菌株，诱导重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag表达；最后回收所表达的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag。 进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌 细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /hJ5nag。 本专利技术的另一目的在于提供一种包含所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重 组载体。 进一步，所述重组载体是将β-Ν-乙酰葡糖胺酶的基因插入到表达载体中，使核苷 酸序列与表达调控序列相连接。 本专利技术的另一目的在于提供一种包含所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重 组菌株。进一步，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。 本专利技术提供的耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及其制备方法，采用新活性的β-Ν-乙酰葡糖胺酶：最适ΡΗ6;最适温度为45°C ;可催化水解几丁寡糖；在反应体系加入终浓度 20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约69.5 %活性;该酶可与内切几丁质酶协同降 解几丁质。本专利技术的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可应用于海产品加工、医学、功能性食品等行业。【附图说明】 图1是本专利技术实施例提供的耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制备方法流程图。 图2是本专利技术实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的 SDS-PAGE 分析；图中:Μ:蛋白质Marker; CK:含载体pEasy-E2大肠杆菌菌体破碎上清液;S1:含有重 组载体pEasy-E2-hJ5nag的大肠杆菌菌体破碎上清液；S2:纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶 HJ5nag〇图3是本专利技术实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的pH活性。图4是本专利技术实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的pH稳定性。 图5是本专利技术实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的热活性。图6是本专利技术实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的热稳定性。 图7是本专利技术实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag水解二乙酰壳二 糖及四乙酰壳四糖的产物分析；图中：M:N-乙酰-D-胺基葡萄糖;CK1:二乙酰壳二糖与灭活的HJ5nag;Sl:二乙酰壳 二糖与有活性的HJ5nag，CK2:四乙酰壳四糖与灭活的HJ5nag;S2:四乙酰壳四糖与有活性的 HJ5nag〇 图8是本专利技术实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag在不同浓度N-乙 酰-D-胺基葡萄糖中的活性。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于 限定本专利技术。 下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。 本专利技术所述β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag可得自微杆菌（Microbacterium sp ·)。 HJ5nag的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。 微杆菌(Microbacterium sp.)，遗传资源属于微生物，获取方式为自行采集;于 2010年10月，由周峻沛在中国、云南省、楚雄彝族自治州采集。 本专利技术的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag总共含535个氨基酸，理论分子量为55.89kDa， 其中N端有25个氨基酸为预测信号肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA，成熟的β-Ν-乙酰葡 糖胺酶HJ5nag含510个氨基酸。该酶最适ρΗ6;最适温度为45°C;可催化水解几丁寡糖;在反 应体系加入终浓度20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约69.5 %活性;该酶可与内 切几丁质酶协同降解几丁本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐产物抑制的β‑N‑乙酰葡糖胺酶，其特征在于，所述耐产物抑制的β‑N‑乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，张蕊，黄遵锡，宋志凤，唐湘华，李俊俊，吴倩，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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