PRSS8检测试剂在制备结肠癌早期及预后诊断试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术和医学技术领域，提供了检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂在制备结肠癌早期及预后诊断试剂盒中的应用。本发明专利技术还提供了一种结肠癌早期及预后诊断试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒对结肠癌进行早期筛查具有操作简单、高特异性、高灵敏性的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术和医学
，特别涉及一种PRSS8检测试剂在制备结肠 癌早期及预后诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生和进展主要与抑癌基因的失活、原癌基 因的激活有关。结肠癌的关键在于早发现、早诊断和早治疗。结肠癌的预后主要取决于早期 诊断和及时手术治疗。生物标记物(biomarker)是近年来随着免疫学和分子生物学技术的 发展而提出的一类与细胞生长增殖有关的标志物。 PRSS8是一种丝氨酸蛋白酶，有研究表明PRSS8在正常的前列腺和精液中高表达， 以及在很多种组织的上皮细胞中高表达，且与末端上皮分化有关。此外，PRSS8在表皮屏障 功能、皮肤表型以及胚胎存活率方面也起着比较重要作用。有研究发现，PRSS8与卵巢癌的 化疗有关，当增加 PRSS8的表达时可以导致卵巢癌细胞死亡。此外，目前也已证实PRSS8对前 列腺癌，乳腺癌，膀胱癌以及胃癌也有抑制作用，这些研究表明PRSS8在肿瘤的发生、发展中 起重要作用，但是目前还没有PRSS8与结肠癌早期及预后诊断相关的报道。
技术实现思路
针对现有结肠癌早期和预后诊断技术的不足，本专利技术的目的是开发PRSS8在结肠 癌早期和预后诊断中的应用。 为实现上述目的，本专利技术提供了检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂在制备结肠癌早 期及预后诊断试剂盒中的应用。 其中，结肠癌早期诊断包括结肠腺瘤和结肠腺癌的早期诊断。 其中，所述检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂包括实时荧光定量PCR引物对，在所述 PCR引物对中， 上游引物序列为：5/-六6六66六0六了66了6了6了6(^6-3/; 下游引物序列为:5/-6厶66(^66厶61'1'(^611^0：-3/。其中，所述检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂还包括本领域用于PRSS8检测的已知和 未知的其他生物化学试剂，例如，为ELI SA、PCR检测试剂、抗体等。 本专利技术还提供了一种结肠癌早期及预后诊断试剂盒，所述试剂盒含有丝氨酸蛋白 酶PRSS8编码基因的实时荧光定量PCR引物对，在所述PCR引物对中， 上游引物序列为：5/-厶6厶66厶0厶了66了6了6了6(^6-3 /; 下游引物序列为:5/-6厶66(^66厶61'1'(^611^0：-3/。 该试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和PCR反应常用的酶。 作为优选，试剂盒包括:组织总RNA提取试剂、逆转录试剂以及定量PCR试剂。 其中定量PCR试剂中还包括内参GAPDH的特异引物： 内参GAPDH的特异引物： 上游引物：5' -GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3'， 如SEQ ID N0:3所示； 下游引物：5' -AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'，如SEQ ID N0:4所示。本专利技术的有益效果:本专利技术提供的试剂盒通过检测PRSS8的mRNA表达水平，可以对 结肠腺瘤、结肠腺癌患者进行早期诊断，通过免疫组化技术检测PRSS8的蛋白表达水平，根 据肿瘤分化程度以及病人生存期对患者预后作出评价。本专利技术在医学和分子诊断领域有重 大实际意义和巨大的应用价值。【附图说明】图1为PRSS8在38例结肠癌和邻近正常组织中的表达情况。图2为PRSS8在32例结肠腺瘤和邻近正常组织中的表达情况。图3为PRSS8在正常结肠组织，高分化结肠癌，低分化结肠癌中的免疫组化染色结 果。 图4为PRSS8的表达水平与276例结肠癌病人的生存期关系。【具体实施方式】 下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径 得到。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具 体条件的试验方法，通常按照常规条件。 实施例1PRSS8在结肠癌和邻近正常组织标本中的差异性表达 1、材料及试剂： (1)人结肠组织标本收集从新乡医学院第一附属医院2012年11月至2014年12月间收集38例新鲜结肠癌标 本及其临近的正常结肠组织标本，32例新鲜结肠腺瘤标本及其临近的正常结肠组织标本， 储存于_80°C冰箱中，提取RNA用来做实时荧光定量PCR。所有病人均书面告知，标本收集均 经新乡医学院伦理审查委员会同意。 (2)试剂盒的组装 mRNA定量的反应体系：上游引物（20μπι)、下游引物（2(^111)、〇0财、!120、荧光染料 SYBR Green。 PRSS8实时荧光定量PCR的上游引物为5' -AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3';下游引物为 57-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3 7 〇 内参GAPDH实时荧光定量PCR的上游引物为5' -GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3';下游引 物为5' -AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'。 2、总RNA 提取 按照操作手册步骤用Trizol试剂（Invitrogen, Carlsbad，CA)分别提取冰冻的结 肠癌及其邻近正常结肠组织的RNA，结肠腺瘤及其临近的正常结肠组织的RNA。 3、逆转录和实时荧光定量PCR 用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo SCIENTIFIC，USA)按 操作手册对mRNA进行逆转录。 逆转录的反应体系：总RNA lyg，逆转录引物1μ1，ΑΜν buffer 2μ1，ΑΜν 0.5μ1， 10mM dNTP 0.5yl，MgCl2 2μ1，总体积 10μ1;反应条件：42°C60min，70°C10min，冰上放置 2min〇 用步骤1组装的试剂盒，通过实时焚光定量PCR(Applied Biosystems Inc.)对 PRSS8进行定量分析。 mRNA定量的反应体系：上游引物（20μπι)0·15μ1，下游引物（20ym)0.15yl，cDNA 0.7 μL，H2O 9μ1，荧光染料SYBR Green(2X) ?ομL;反应条件：50°C2min，95°C2min;变性95°C15s， 退火/延伸60°C lmin，共40个循环。 PRSS8实时荧光定量PCR的上游引物为5' -AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3';下游引物为 57-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-37 〇 内参GAPDH实时荧光定量PCR的上游当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测丝氨酸蛋白酶PRSS8的试剂在制备结肠癌早期及预后诊断试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍永华，杨万才，郭永臣，杨一琼，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37